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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】pcr体系和产物浓度
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ch2009121

铁虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】pcr体系和产物浓度

下面是我设计的pcr体系如下：
水：9.8  ul
B： 2.8  ul
Mg2+ ：3.0  ul
dNTP：2.0  ul
引物： 2.2+2.2  ul
DNA： 2.5  ul
酶：   0.5   ul
DNA 是植物的   扩增片段为600bp左右
DNA的浓度分别做了稀释：10倍，20倍，30倍，40倍，50倍，100倍。
引物为特异性引物
循环参数：  94℃  3min
                 94℃  30s   50℃  45s   72℃  10 min  （40个循环）
                72℃  10min
而且pcr产物的浓度较低

请大家帮我看看设计的是否有问题，是什么原因导致产物的浓度低呢，谢谢大家！！！！！！

[ Last edited by ch2009121 on 2009-12-21 at 14:02 ]
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1楼 2009-12-21 10:44:43
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stelyo

新虫 (初入文坛)
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amisking(金币+3,VIP+0): 12-21 19:10
扩增较弱的原因有很多啊。首先，你都没有说你的扩增片段多大，什么的DNA。如果扩增片段不是超大，用不着再循环中延伸10min吧？！dNTP,引物等浓度也不知道。一般来说退火温度过高，引物设计不合理，试剂浓度不合适，模板浓度过低等都会造成产物浓度低。还有一个容易忽视的问题，看看合成公司有没有把引物合错。我们这就出现过这种情况，再合成就扩增特好了。
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2楼2009-12-21 11:31:50
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hywang131

新虫 (初入文坛)
DNA浓度稀释的过低。
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3楼2009-12-21 13:58:37
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jianglimin

★
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你的退火温度有没有问题，做个touch down试试
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4楼2009-12-21 14:00:06
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
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amisking(金币+3,VIP+0): 12-21 19:10
amisking(金币+5,VIP+0):鼓励新虫发帖！ 12-21 19:10
首先降低一下退火温度，如果不好，调整一下模版浓度，高低都可能有问题，实在不行，建议如楼上所说，做个降落PCR。但是以上建议是体系不存在问题的情况，你的体系没有交代清楚引物的浓度，引物浓度是扩增强弱的主要因素，酶的浓度也没有交代，照正常浓度你的酶用量好像太大了，有的时候酶中的甘油会抑制PCR反应
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5楼2009-12-21 16:58:25
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love_st

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
循环中的72度延伸时间实在太长，1min足够
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6楼2009-12-21 18:26:43
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