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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【分享】大肠杆菌感受态细菌的制备与转化
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apple-z

银虫 (小有名气)

[交流] 【分享】大肠杆菌感受态细菌的制备与转化

大肠杆菌感受态细菌的制备与转化



一、 受体菌的培养
　　从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。

二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
　　1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
　　2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
　　3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
　　4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。

　三、 转化
　　1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。
　　2、 加入质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟。
　　3、42℃水浴中热击90秒,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
　　4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含抗生素),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(如Ampr )。
　　5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含抗生素如Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。
　　同时做两个对照:
　　对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
　对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
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1楼 2009-12-16 23:08:25
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
★
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弱问：制备大肠杆菌热击转化感受态，用氯化钙悬浮的时候，轻轻悬浮总是悬不起来，能否稍剧烈一些（振荡）呢？多谢了！
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漫洒英雄泪，相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行？一任俺芒鞋破钵随缘化！
14楼2010-01-05 17:47:54
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普通回帖

liyong1981

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
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amisking(金币+3,VIP+0): 12-17 08:36
4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含抗生素),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(如Ampr )。


建议：国内的研究人员，喜欢做这一步，其实这步完全可以省略，直接涂平板，感受态没问题的话，作出的克隆够你用的了，10000个与1000个，对于你挑的平板来说一样的，关键是节省了时间，国内试验的时间资源太浪费，东西出的慢，这是个小trick,大家可以试一下，呵呵
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2楼2009-12-17 08:34:37
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free-fish

铜虫 (正式写手)
学习了
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3楼2009-12-17 09:01:45
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bbyu007

木虫 (正式写手)
可以不恢复啊，厉害啊 我试试看
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我是笨笨鱼~~~
4楼2009-12-17 09:20:30
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ln0401

新虫 (初入文坛)
我也是这样做的，不用恢复，效果挺好的！
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5楼2009-12-17 09:27:40
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
★
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弱弱地问一下：

　4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。

分装后需不需要用液氮冷激一下再放到-70℃保存呢？
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6楼2009-12-17 09:53:14
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
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貌似不需要，其实感受态制备并不是很麻烦，现在现用好一些，我们做得放-20度，半个月后再用也是一样的好，但是还是新鲜的好
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7楼2009-12-17 10:58:18
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sand0811

金虫 (初入文坛)
★
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我想问问往感受态里加连接产物的时候需要特别小心吗，可以吹吸一下不？
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8楼2009-12-18 14:03:48
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
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可以~但是一定要很轻，
很轻，不要有气泡，其实你顺时针旋转管子就OK的

我的经验，几年前，我做实验的时候，有两只，马上要热击了。从冰盒拿出来的时候，其中一支摔地上了，其结果是，被摔的那只，长出的克隆比另一只少了有80%，
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9楼2009-12-18 16:43:01
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apple-z

银虫 (小有名气)
吹吸应该没问题的，我就是这么做的，没什么问题
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10楼2009-12-18 16:43:21
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