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【分享】大肠杆菌感受态细菌的制备与转化
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大肠杆菌感受态细菌的制备与转化 一、 受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。 二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) 1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。 2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。 3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。 4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。 三、 转化 1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。 2、 加入质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟。 3、42℃水浴中热击90秒,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。 4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含抗生素),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(如Ampr )。 5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含抗生素如Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。 同时做两个对照: 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。 |
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3楼2009-12-17 09:01:45