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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】昨天看了本韩国的实验技术的书，把我吓了一跳！
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刘仕博

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】昨天看了本韩国的实验技术的书，把我吓了一跳！

最近因为那个破real time的实验弄的我一天在这里大呼小叫的，呵呵~
昨天翻了下实验室里放的实验书，真的把我吓了一跳。
我之前找引物的时候用的黄金法则都是在网上看的咱们国内的。当时师姐倒是也给我说过，就是按那本书说的，但我那个时候对这个实验实在没有sense，她一说我一听。
昨天又去翻那本书，对PCR引物的设计规则里面有一条，就是3‘段尽量避免出现T，对A确没有什么交代。不过看看网上说的，大部分都是说避免出现A，最好是T，我就很迷惑了。
不知道哪位高手给解释下~
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生命在于折腾~
1楼 2009-12-15 17:03:46
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yiyiglad

★ ★ ★ ★
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amisking(金币+3,VIP+0): 12-15 19:55
引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。
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2楼2009-12-15 19:52:18
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刘仕博

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by yiyiglad at 2009-12-15 19:52:
引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。

综上所述，韩国人脑子不太好
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生命在于折腾~
3楼2009-12-15 21:12:37
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刘仕博

金虫 (著名写手)
不过今天我们实验室的一个印度技术教授又和我说找引物的时候如果5’段是A或者T会更好些，快论证下，呵呵~
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生命在于折腾~
4楼2009-12-15 21:24:54
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apple-z

银虫 (小有名气)
★
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是听说引物3‘末端最好不要是A或T之类的说法，但是事实证明通常情况下影响不会很大。
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5楼2009-12-16 00:15:07
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刘仕博

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by apple-z at 2009-12-16 00:15:
是听说引物3‘末端最好不要是A或T之类的说法，但是事实证明通常情况下影响不会很大。

我也一直这么觉得但是没赶说。
那这么说来找引物的话差不多50%技术50%运气了，呵呵~
之前找了几个引物，什么毛病都没有，不过也是不行。没有别的办法，就得重新找。
之前看过一个帖子，那人说他们教授找引物什么都不用，拿过来看个10分钟，然后大概算个Tm值就可以了，然后效率都可以。我总感觉这和老中医差不多，一天把脉看舌苔的，然后就知道你有啥病了，不过换个新人可能就说不这么准了。
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生命在于折腾~
6楼2009-12-16 00:41:14
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松上云雀

木虫 (正式写手)
★
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我也是新手，来学习下。
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7楼2009-12-16 08:50:42
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yiyiglad

呵呵，怎么你们实验室技术老师那么多想法啊。一般，我们直接用primer primer5.0直接设计，一般都没有什么问题的。
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8楼2009-12-16 09:35:02
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bioxixi

木虫 (著名写手)
★
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哈哈
如果条件允许我会尽量避免用A和T，但是个人觉得影响不大
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9楼2009-12-16 11:24:11
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刘仕博

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by yiyiglad at 2009-12-16 09:35:
呵呵，怎么你们实验室技术老师那么多想法啊。一般，我们直接用primer primer5.0直接设计，一般都没有什么问题的。

我在对这个东西还没有那么多认识的时候找的引物也算可以。后来知道的多了，找的引物反倒不能用了。而且做标准曲线的时候效率都在70-80%，然后再怎么降温都不管用了，实在找不出原因也就只能扔了。
我做的是real time，据说这个对引物要求比较高。大家都说让我多找几对，虽然要用的引物比较多，但我现在打算这么做
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生命在于折腾~
10楼2009-12-16 11:40:00
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