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paulajjh木虫 (著名写手)
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[交流]
【求助/交流】易错PCR与定点突变PCR
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如题,谁帮忙解释下易错PCR与定点突变PCR的概念,两者的区别与联系, 及各自的优劣势.谢谢 另,易错PCR如果得到某一突变株, 那别人重复其实验是否也可得到同样的结果,即该实验的重复性如何? |
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tianpingpe
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paulajjh(金币+4,VIP+0): 12-10 14:54
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定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA 易错PCR: 再PCR反应中，降低一种dNTP的含量，使PCR容易出错，达到随机突变的目的 定点突变是针对某些点，是一直理性设计 易错是一种随机突变。易错要重复你的结果，这个有很多影响的，pcr条件啊，试剂啊，模板等都是有影响的，能筛选到你的突变还要筛选方法等，不能简单的这么说，易错只能统计你的突变率，也就是1000bp里面突变了多少个碱基，但是那些碱基突变是控制不了的 定点的突变的前提是你对某些点的突变有有什么影响有一个大概的方向，是正面的，还是负面的，这个就要你收集很多资料了。易错的话，是随机突变，要想得到你的目标突变的话，和你的突变率以及筛选体系有关系。如果筛选体系不行的话，比较难得到你的目的突变； [ Last edited by tianpingpe on 2009-12-10 at 13:57 ] |
2楼2009-12-10 13:54:43
qqsvery
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paulajjh(金币+1,VIP+0): 12-10 14:54
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易错PCR: 再PCR反应中，降低一种dNTP的含量，使PCR容易出错，达到随机突变的目的。 定点突变包括下面： 一、 定点突变 1. 寡核苷酸引物介导的定点突变： 是指用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制的过程。 基本步骤： ① 将待突变基因克隆到突变载体上； ② 制备含突变基因的单链模板； ③ 引物与模板退火：5端磷酸化的突变寡核苷酸引物，与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链DNA； ④ 合成突变链： 在DNA聚合酶的催化下，引物以单链DNA为模板合成全长的互补链，连接酶封闭缺口，产生闭合环状的异源双链DNA分子； ⑤ 转化大肠杆菌，产生异源双链DNA分子，复制后，产生野生型合突变型两种DNA分子； ⑥ 对突变基因进行序列分析。 2. 寡核苷酸引物介导的定点突变的Kunkel改进： 将待突变的基因克隆到RF－M13DNA载体上，导入具有dUTP酶和N－尿嘧啶脱核苷酶双缺陷的菌株。dUTP酶缺陷导致细胞内dUTP上升，部分取代dTTP进入新生DNA链中，使得M13单链DNA大约1％的T被U取代，然后进行DNA另一链的合成。再将双链导入正常大肠杆菌中，N－尿嘧啶糖基化酶除去DNA链上的尿嘧啶碱基，原M13模板链被降解，突变链因不含U被保留下来。 3. PCR介导的定点突变 在PCR反应中设计两对引物a和b一对，c和d一对，其中bc两条引物具有相同碱基的一个突变，进行PCR扩增，形成两条一端可彼此重叠的双链DNA区段，除去多余引物后，混合变性、退火，形成具有3端凹陷的异源双链DNA分子。利用外侧一对引物再进行PCR扩增，可产生突变体DNA分子。所以本方法需要3次PCR反应，两对引物。 4. 盒式突变 利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。突变的寡核苷酸链成对存在，不会出现异源双链的情况。全部转化质粒都是突变体。 |
3楼2009-12-10 14:23:11
4楼2009-12-10 16:22:53