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elalei1999铜虫 (小有名气)
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【求助/交流】克隆目的基因遇阻
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在下设计了简并引物，提取植物叶片的RNA，反转录cDNa后，PCR扩Actin，每次都能得到正常的条带，但是加入目的基因引物扩增，要么扩不出东西，要么得到的是引物二聚体。（已采用退火温度梯度） 请大伙给出出主意，我可能是在哪里出了问题。谢谢。 |
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2楼2009-12-09 13:55:31
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这个问题很多人提出来过，我记得我前阵子回答过， 、你扩出保守基因能说明什么呢？首先你要搞清楚，保守基因在RT实验中的作用，它是一个相对定量的内参，或者说是一个你目的基因表达量的相对参照物，扩出来ACTIN是很容易的事，即使你的反转录效率低，CDNA不完全！ 我建议你，1，重新用MLV做一次RT,记住这步很关键， 2，在第一步仔细的基础上，重新设计下引物 ，引物这东西有时候就是很奇怪的，多试试吧， 3.植物的我以前做过，如果你只是在EST重设计一段引物看表达量的话，应该很容易做，如果做RACE或者其他，那就费点事了，慢慢来 4，有引物二聚体说明你体系基本问题不大 5，RT后的第一链CDNA，要注意保存好，最好立马就做扩增，因为你也知道，DNA单链不稳定的，或者你费点事，RT的时候做成双链的 6.希望对你有帮助 |
4楼2009-12-09 14:16:31
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7楼2009-12-10 08:15:21
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8楼2009-12-10 14:55:39
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