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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于PCR条件的优化！（有弥散）
汕头大学海洋科学接受调剂
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melodyxin

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于PCR条件的优化！（有弥散）

如图，是我的PCR结果。

上面那条带是我要的目的片段，下面的是非特异性片段。

很郁闷啊，目的片段周围糊糊的，感觉有弥散且有杂带。本来想要切胶回收，但这种情况感觉回收回来的条带会非常不纯。

基本情况：是从已有的质粒上面扩增其中一段。其中下游引物是之前用过的，完全匹配，其Tm值在63度；而上游引物是自己设计的，还引入了酶切位点。如果删去需引入的酶切位点，其Tm大概才45度，但加上引入的酶切位点，该引物的Tm也是63度。

现在的PCR条件是50度，如果升到55度，则P不出目的条带，在该大小附近几乎都是弥散状的条带。

请大家指点一二！！！


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1楼 2009-12-08 19:58:40
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xiaoli9390

金虫 (初入文坛)
amisking(金币+0,VIP+0):这段时间附件功能不能用，不过马上就会修复。 12-8 20:13
看不到你的图片啊
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2楼2009-12-08 20:05:11
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melodyxin

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by xiaoli9390 at 2009-12-8 20:05:
看不到你的图片啊

amisking(金币+0,VIP+0):这段时间附件功能不能用，不过马上就会修复。
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3楼2009-12-08 20:15:30
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amisking

荣誉版主 (文坛精英)

优秀区长优秀版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by melodyxin at 2009-12-8 20:15:

amisking(金币+0,VIP+0):这段时间附件功能不能用，不过马上就会修复。

我给他评分以后他会收到那条信息的。
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如果没有人帮助你，那么你就去帮助别人。
4楼2009-12-08 20:24:17
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yzhang1986

铁杆木虫 (文坛精英)

优秀版主
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2,VIP+0): 12-8 20:46
做个梯度
不行的话重新设计引物
赞一下(21人) 回复此楼
5楼2009-12-08 20:37:19
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melodyxin

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yzhang1986 at 2009-12-8 20:37:
做个梯度
不行的话重新设计引物

你是说对退火温度做梯度么？
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6楼2009-12-08 20:40:19
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yzhang1986

铁杆木虫 (文坛精英)

优秀版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by melodyxin at 2009-12-8 20:40:

你是说对退火温度做梯度么？

当然啦
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7楼2009-12-08 20:56:26
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jlzkchong

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+3,VIP+0): 12-8 21:33
你可以先用45度做5个循环，再将退火温度提高到63度。做25个循环，试一试吧~非特异条带说明你的引物特异性不好。先试试，不行就再重新设计上游引物吧~
赞一下(21人) 回复此楼
8楼2009-12-08 21:05:36
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melodyxin

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jlzkchong at 2009-12-8 21:05:
你可以先用45度做5个循环，再将退火温度提高到63度。做25个循环，试一试吧~非特异条带说明你的引物特异性不好。先试试，不行就再重新设计上游引物吧~

好的！多谢呐！
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9楼2009-12-08 21:21:51
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