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davidck金虫 (正式写手)
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[交流]
【求助/交流】关于细胞内信号分子的作用方式
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大家说说细胞内信号分子的作用方式吧... 我现在做的是原核生物，以枯草芽孢杆菌为模式生物，在做一些关于细胞内的一些小的关于biofilm形成的signal，及其pathway 前面一个毕业生的课题中指出一个蛋白，具有两种调控方式，一个方式是作为激酶，另一个方式未明，也就是我现在做的方向。 问题是，他指出具有另一个调控功能的区域大概只有20个氨基酸，而且是固定在膜上，大家觉得有可能通过什么方式在起作用呢？ 我现在做pull down，希望能发现一些能与之结合的蛋白，但是感觉希望好小，同时老板也在让我做一些有可能与之作用的downstream的信号蛋白的突变体，来碰，看是不是通过其来发生作用，这种方式也很盲目啊... 大家有什么好的想法没有，关键我是觉得这个功能域太小了，才20个AA，而且是固定在膜上的，能怎样的发生作用啊，唉~~~~~~~ |
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qiang84zhang
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2楼2009-12-08 09:30:08
davidck
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3楼2009-12-10 08:44:59
davidck
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是不是嫌弃金币太少了？4楼2009-12-11 07:20:46
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davidck(金币+5,VIP+0):谢谢，收益良多，希望多多交流.... 12-12 07:48
davidck(金币+5,VIP+0):谢谢，收益良多，希望多多交流.... 12-12 07:48
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仁兄的这种做法称为“钓鱼”，只可惜人生苦短，一旦钓不上大鱼，而或钓到的竟是些水草杂物，经不起几个春秋的折腾。最好还是编织一张渔网来捞为好。 你说的目的蛋白看来是一个靠20氨基酸铆钉在细胞膜上的激酶。跨膜区域通常也就20个氨基酸，不会再有其它功能（只是将激酶固定在膜上）。 然而，与激酶作用的蛋白质无非几种情况：激酶的激酶（激酶上游的激酶，用来将下游的激酶磷酸化，使其具备激酶的活性；当然有的激酶上游没有激酶了，不过这样的激酶应当还有其它的结构域，以感受信号分子）、激酶的靶蛋白（激酶将它磷酸化，使它活化去行驶相应的下游功能）、激酶的磷酸酶（作用是将活化的激酶的磷酸去掉，使激酶恢复沉默状态）。 这几种情况都涉及到磷酸化。要知道磷酸化很多是转瞬即逝的。通过pull-down能钓到目标吗？难于上青天！所能钓到的蛋白质可能不少，却尽是些假相互作用的，也就是那些水草杂物。 而或仁兄选择其中一两种被钓到的“鱼”继续来往下做。还要做双杂交来验证。最终证明是伪的，那就浪费青春了。 倒不如，整个实验室做一张“渔网”，构建细菌（或酵母）双杂库。库的一半是各种激酶，库的另一半是各种潜在的互作蛋白。通过激酶和潜在互作蛋白的相互作用，在库里把真鱼筛选出来。这鱼是真的，而且还不止一条，够更多师兄弟姐妹毕业受用的了。 [ Last edited by 叔扬 on 2009-12-11 at 10:44 ] |
5楼2009-12-11 10:41:18
davidck
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楼上兄台的建议令我收益良多啊，谢谢先 不过，可能是我没有把问题说清楚，我再说具体点，希望还能得到些帮助： 我的目的蛋白是typeI signal peptidase，其这个方面的功能已经研究的很清楚了，其功能域在胞外的一个酶活中心里；但是我们同时发现了其另外一个独立的功能，这个功能也清楚了，是与biofilm形成中的sruface-adhere有关，然后就是我前面说的，通过构建不同的突变体，竟然发现这个调控功能的区域存在于胞内的一个小尾巴上，也就是我说的那20个氨基酸，现在对于这20个大小的小东西的作用方式很是奇怪：固定在胞内，没有三级结构（也就说，”可能“不具备任何酶活），那它能以什么形式发生作用呢？ 需要注意的是，这个20aa的调控作用与其peptidase作用是相互独立，这个是已经被证明了的，当然，说实话，我也没法完全保证其调控作用是完全的基于这20个aa，头疼ing 大家见过有什么作用方式能适用于这么小的固定的蛋白序列么？ [ Last edited by davidck on 2009-12-12 at 07:49 ] |
6楼2009-12-12 07:47:46
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davidck(金币+3,VIP+0):谢啦，这可能是一个方面，另一方面，我们想做的是想知道关于这个小尾巴的和分泌蛋白无关的功能。。 12-18 04:17
davidck(金币+3,VIP+0):谢啦，这可能是一个方面，另一方面，我们想做的是想知道关于这个小尾巴的和分泌蛋白无关的功能。。 12-18 04:17
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原来不是激酶。 我觉得你说的“小尾巴”有两种可能功能。 第一种：信号肽酶的跨膜区域嵌在膜里，如果没有某种固定机制，就会随着细胞膜的运动而到处漂流，而不能在适当的地点发挥作用。那个小尾巴可能将信号肽酶固定到一个特定区域，这个区域汇集了核糖体以及分泌蛋白转运元件。小尾巴也可能直接和核糖体互作，把它牵引过来，以使得分泌蛋白能在这个区域表达。 第二种：小尾巴是直接和分泌蛋白作用的，只有当小尾巴和分泌蛋白前体结合，将其拉进到信号肽酶，才能够将其信号肽切除，将分泌蛋白释放。分泌蛋白正确地被释放，就有效地参与到胞外生物膜的合成当中去。 这样的Pull-down应该比较好做。甚至你不妨自己表达一些潜在的互作蛋白（核糖体、分泌蛋白、信号肽、分泌蛋白转运相关蛋白）来验证。 [ Last edited by 叔扬 on 2009-12-14 at 10:01 ] |
7楼2009-12-14 09:55:55