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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】双酶切的两个酶最适反映温度不一样怎么办？
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jlzkchong

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】双酶切的两个酶最适反映温度不一样怎么办？

请教虫友，最近我在做质粒的双酶切，其中用到两组酶，BamHI+SalI和ClaI+SalI分别进行双酶切，酶均购自TAKARA公司，通过产品目录查询，发现两组酶中的两个酶的最适温度都是一个30度，一个37度，我开始没发现这个问题，混合后直接放到37度酶切，结果发现质粒似乎只被单酶切了，没有切下目的小条带，请问各位虫友有没有解决类似问题的好方法，在此谢过了！
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1楼 2009-12-07 21:56:45
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1、先用30度的酶单酶切，回收换Buffer加和酶再37度酶切。但是还要回收，酶切的质粒可能有损失。
2、也可以30度切一段时间后再放到37度切。这样比较省事，但是有时候酶可能切的不完全。
3、也有可能你的质粒已经切开了，但是你跑电泳的时间较长，导致小片段看不见了，因为小片段结合的EB肯定少，一般比较暗。
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2楼2009-12-07 22:36:55
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qiang84zhang

银虫 (正式写手)
建议用楼上的第一种方法,我们都是这么做的
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3楼2009-12-08 09:39:25
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tianpingpe

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
选择酶切效率都比较高的buffer，先在30度反应2hr，然后在37度反应，一般都没有太大问题。片段小的话，就多酶切几个体系，在一个孔电泳，保证量和酶切效率
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4楼2009-12-08 09:39:58
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最爱花诗雨

金虫 (正式写手)

穷鬼
踩过
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严于律己，宽以待人
5楼2009-12-08 10:02:10
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jlzkchong

新虫 (初入文坛)

谢谢

谢谢楼上几位虫友的解答，我想问问你们都用什么胶回收的试剂盒？！一般回收完了你们是否测过回收以后的浓度？！效率高不高？推荐一下比较好用的胶回收试剂盒吧~！
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6楼2009-12-08 18:58:12
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