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[交流] 怎么判断双酶切是否切开？

原核载体pET28，内切酶是XbaI和XhoI，宝生物的，我的体系是
XbaI 1
XhoI 1
10  Buffer 2
载体    16（浓度较低，用的较多）       反应  37度 4小时，
请问：怎么判断我的载体是否切开了？除了跑胶之外，各位虫友有什么好的方法  判断么？

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1楼 2009-12-02 08:33:24

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liyong1981

金虫 (正式写手)

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高浓度的琼脂糖胶，和原始质粒对比跑电泳，看仔细可以看得出来的，

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3楼2009-12-02 09:07:09

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漫迹

金虫 (小有名气)

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PCR看能P出目的片段来，有的话应该是连上了，PCR产物也可以进行T连接，双酶切进一步验证

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4楼2009-12-02 09:48:19

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lzhwin

木虫 (正式写手)

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amisking(金币+3,VIP+0): 12-2 12:34

跑电泳是最简单的方法啊，楼主酶切的目的是什么？验证还是要胶回收连接目的片段呢？
把样品全点进去，然后点marker，如果切开的话因为是线性DNA应该能显示PET28的正确大小。如果酶切不完全会看到两条带（没切开的质粒和切开的质粒）。

如果是做胶回收楼主的体系太小，会导致酶切不完全或者量不够回收。不知道楼主是用什么方法提的质粒，浓度再小加16微升也太多了。
我们一般验证用10微升体系，质粒一般加2-4微升，酶切回收的话一般用40-80微升体系。酶的用量要尽量按照说明书等比例扩大或者缩小。

[ Last edited by lzhwin on 2009-12-2 at 12:10 ]

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5楼2009-12-02 12:08:54

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