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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于克隆的假阳性
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溪儿维娅

铜虫 (小有名气)

[交流] 关于克隆的假阳性

我最近做的克隆转化，平板上隔夜都会长出单克隆，但是为什么每次都提不到质粒呢？我也用氯霉素扩增质粒的方法了，但还是提不出来。我咨询过老师和同学，他们有的回答，可能我的平板上长出来的都是假阳性。
     不知道究竟是怎么回事。那位高人能不能帮我分析一下啊。谢谢啦

[ Last edited by amisking on 2009-11-21 at 16:36 ]
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1楼 2009-11-21 00:45:17
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龙井茶室

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lz说的比较简单
你最好说下你的感受态是什么（DH5a？），质粒用的是什么,什么抗性（cm吗？），
单克隆的数量多少（>100）？
假阳性一般都是连的小片段，建议切胶回收再连
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2楼2009-11-21 01:13:59
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09021122

木虫 (正式写手)
★
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同意二楼的观点，你用的感受态是什么，质粒有是什么？
最好是割胶回收分析。也有可能不是假阳性呢？
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雄关漫道真如铁，而今迈步从头越
3楼2009-11-21 08:04:01
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cecilia801537

铁虫 (小有名气)
★
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lz的问题是提不出质粒来 可能是你的平板忘加抗生素了？
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4楼2009-11-22 00:28:07
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
要先验证是不是阳性菌落，如果是的话再抽质粒。
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5楼2009-11-22 00:33:09
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qingfengwu

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
感受态有可能也污染了。
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6楼2009-11-22 01:28:33
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fenghaizai

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
抗生素失效的可能性比较大
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7楼2009-11-22 13:55:10
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溪儿维娅

铜虫 (小有名气)
谢谢各位。我再说的详细一点。
我用的是电转化专用的高效感受态，抗性是Spc+Km. 我是提的蓝藻基因组DNA后直接进行的酶切和连接，用试剂盒回收后进行的电转化。平板都是提前准备好的，抗生素可以放心，绝对没有加错或忘加。
37度培养后第二天就长出的单克隆，但是每个平板的克隆数<100个。摇菌后一夜菌液浓度也比较大，但就是提不出质粒。
  在这之前我尝试的是GOLD X 高效转化感受态，没想到连单克隆都涨不出来。
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8楼2009-11-23 23:56:46
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
抗生素有问题吧，或者长出的是杂菌，
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9楼2009-11-24 07:55:39
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溪儿维娅

铜虫 (小有名气)
抗生素应该没问题，是我老师配的，一直用这些抗菌素平板来长我的蓝细菌。不知为什么到了感受态转化克隆就长不出菌来了
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10楼2009-11-25 00:24:41
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