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[交流]
不同材质微载体制备外泌体，一个电镜下的意外发现。
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最近在做 msc 外泌体的规模化培养，对比了纯明胶微载体和明胶修饰海藻酸微载体，同时跑了 t175 平面培养作参照。两边细胞密度、培养时间、上清收集和超速离心流程都尽量一致，送了透射电镜。结果有点出乎意料。 两种载体的形貌 两种载体都不是光滑的球： 纯明胶微载体表面多孔、孔较深，像海绵； 明胶修饰海藻酸微载体表面也有沟壑坑洼和多孔结构，类似月球表面，但孔的数量和深度都比纯明胶少和浅。 电镜下的差异 四组照片放一起，差别非常直观。明胶修饰海藻酸组的洁净程度和 t175 平面培养在同一水平，纯明胶组则明显更脏。 低倍镜下：明胶修饰海藻酸组背景干净，囊泡散在分布、大小均一，几乎看不到杂质聚集；纯明胶组明显更脏，视野一侧有大片深色不规则聚集物，颗粒大小不均，还有很多细小碎片点，背景不通透；t175 平面组背景干净，囊泡散在均一，观感和明胶修饰海藻酸组非常接近。 高倍镜下：明胶修饰海藻酸组杯状外泌体结构清晰、形态完整，背景几乎无杂质；纯明胶组虽也能看到外泌体，但囊泡周围环绕大量无定形深色物质，部分外泌体与杂质聚集成团，还可见较大的不规则膜性结构；t175 组外泌体形态清晰，背景干净。 原因猜测（未验证） 1. 明胶降解产物混入沉淀。 明胶是变性胶原，37℃下偏软，且是 msc 分泌的 mmp 的天然底物。纯明胶载体整个基质都可被降解，释放大量多肽片段，超速离心时可能与外泌体共沉淀，电镜下表现为囊泡周围的无定形深色絮状物。明胶修饰海藻酸的骨架是多糖，不被 mmp 降解，表面明胶层量有限，降解产物不在一个量级。 2. 深孔结构导致内部坏死。 纯明胶载体孔深，细胞可钻入内部生长，但核心区域营养和氧气供应不足，易发生坏死，释放 dna、组蛋白和细胞器碎片。深孔还可能滞留这些坏死物质，在搅拌收集时逐步释放。明胶修饰海藻酸孔少且浅，细胞主要在浅层活动，营养供应均匀，坏死少，杂质谱因而接近平面培养。 3. 比表面积与代谢负荷差异。 纯明胶载体比表面积大、细胞密度高，营养消耗快、乳酸和氨积累多，微环境恶化加速细胞状态下滑，碎片和凋亡囊泡增多。明胶修饰海藻酸细胞密度适中，代谢环境更稳定。 一点感想 做外泌体规模化，大家往往先盯产量 —— 哪种载体细胞多、颗粒数高。但这次电镜提醒我，纯度可能是更易被忽略、影响更大的指标。杂质多的制剂，功能实验易出假阳性，组学背景噪音大，临床级生产中工艺杂质的清除和验证更是成本大头。 微载体选择需要在产量与纯度间找平衡。不是越 "生物相容"、孔越多越深、细胞长得越旺就越好 —— 材料稳定性、降解产物是否混入产物、孔结构是否导致内部坏死，同样是硬指标。 以上为初步观察与猜测，后续需定量数据支撑。欢迎做过类似体系的朋友交流。  |
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