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单细胞测序样本制备与质控运输全流程指南
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单细胞测序技术突破了传统 bulk 测序 “平均化” 检测的局限，能够解析单个细胞层面的基因表达谱、细胞异质性、细胞亚群分型及细胞间互作关系，在发育生物学、肿瘤微环境解析、免疫机制研究、临床疾病标志物挖掘等领域得到广泛应用。单细胞测序最终数据质量高度依赖上游原始样本的处理方式、细胞活性质控以及冷链运输规范，样本处理不当极易造成细胞凋亡、RNA 降解、细胞成团，最终导致测序数据失效。本文结合标准化实验规范，系统梳理单细胞测序适用样本类型、前处理操作要点、质控判定标准与样本运输要求，为科研工作者开展单细胞测序项目提供完整实操参考。 一、单细胞测序适用样本类型及标准化前处理方案 单细胞测序可适配多种来源样本，包括血液样本、体外培养细胞、临床及动物组织样本、速冻组织样本，不同样本的取材、分离保存操作存在明显差异，标准化操作流程如下： 1、血液样本 采血选用 3 mL 或 5 mL EDTA-K2 真空采血管，采血完成后轻柔颠倒采血管 5–8 次，保障抗凝剂与全血充分混匀，避免凝血。样本常温直立放置，推荐在 4–6 h 内完成外周血单个核细胞（PBMC）提取。也可将分离得到的 PBMC（约 5×10⁵个）重悬于专用细胞冻存液，程序降温后置于液氮长期保存，用于后续上机。 2、体外培养细胞 分为贴壁细胞与悬浮细胞两类： 贴壁细胞：选取生长状态优良、无污染的细胞，经胰酶充分消化，收集全部细胞悬液；室温 300 g 离心 5 min，弃上清，使用预冷 PBS 重悬洗涤细胞，重复洗涤 2 次去除残留培养基、胰酶杂质。 悬浮细胞：直接收集细胞悬液至离心管，室温 300 g 离心 5 min，弃上清，PBS 重悬清洗细胞，重复 2 次。 培养细胞全程置于冰上操作维持细胞活性，尽量 2 h 内制备单细胞悬液；如需留存备份，可取约 5×10⁵个细胞重悬于细胞冻存液，程序降温液氮保存。 3、新鲜组织样本（临床组织、动物组织） 临床或动物取材后，选取湿重 100–200 mg（约绿豆粒大小）的目标组织块，投入预冷组织保存液中，低温保存转运。组织保存液可延缓组织内细胞凋亡，延长样本耐受时间，保障后续解离后细胞活性。 4、速冻组织样本 取湿重 100–200 mg 新鲜组织放入无 RNase 离心管，迅速投入液氮快速速冻，之后转移至 - 80℃冰箱长期保存，样本运输全程采用干冰低温运输。该方案适合部分无法即时完成组织解离的样本，可保留组织内核酸信息用于后续检测。 二、单细胞测序样本质控标准 合格的样本是单细胞测序成功的核心前提，接收样本时会执行严格质控，核心判定指标如下： 1、细胞悬液质控 细胞总数＞10 万（混样联合项目要求每样本＞20 万）；细胞直径＜30 μm；细胞活性＞80%；细胞悬液中碎片、杂质占比低，无明显细胞成团现象。本地送检样本 4℃低温递送，需控制在 1–2 h 内送达，不接收超过 2 h 的外地常温寄送样本。 2、血液样本质控 采用紫色盖 EDTA 抗凝采血管，采血量 3–5 mL。本地送样可常温或 4℃保存运输，全程平稳放置，避免剧烈震荡颠倒，尽量采血后 4–6 h 内完成 PBMC 抽提；外地送样优先自行抽提 PBMC，梯度降温冻存后干冰运输；若采用 4℃冷链运输，需保证 24 h 内送达实验室再进行 PBMC 提取。 3、新鲜组织样本质控 组织重量≥100–200 mg，搭配组织保存液 4℃冷藏运输，尽量 48 h 内送达实验室完成组织解离制备单细胞悬液。针对含有中性粒细胞等脆弱敏感细胞的样本，建议 12 h 内完成运输及解离，降低细胞凋亡风险。 4、速冻组织样本质控 组织取材后快速液氮速冻，存放于 - 80℃，干冰全程运输，避免反复冻融造成核酸降解与细胞破损。 三、样本运输关键注意事项 1、温度管控：活细胞、新鲜组织优先低温冷藏，速冻样本全程干冰运输，杜绝温度波动； 2、时效管控：不同样本设置对应的送达时限，脆弱免疫细胞样本尽量缩短运输时长； 3、防震荡：血液样本、活细胞悬液运输过程避免剧烈摇晃，防止细胞破损、溶血； 4、防污染：所有耗材选用无 RNase、无菌级离心管，操作全程避免外源核酸酶与微生物污染。 四、不同样本类型适用研究方向说明 PBMC 血液样本：多用于免疫细胞分型、自身免疫病、肿瘤外周免疫景观、感染免疫相关研究； 体外培养细胞：适合细胞分化模型、药物刺激细胞响应、细胞谱系机制探索； 新鲜组织样本：适配肿瘤微环境、器官发育、损伤修复等，可获得更高活性原位细胞； 速冻组织：多用于回顾性队列样本，适合回顾性临床样本挖掘。 五、小结 单细胞测序从样本取材、前处理、质控到冷链运输是一套完整的标准化流程，每一步操作都会直接影响细胞活性、RNA 完整性和最终测序数据质量。研究人员需要根据样本来源、项目需求选择合适的保存与运输方案，严格把控样本送检时限，减少细胞凋亡、核酸降解、细胞成团等常见问题。规范的样本管理，能够有效降低单细胞测序项目失败风险，保障后续细胞分群、差异基因分析、拟时序分析等生信结果的可靠性。  |
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