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yanxiangru金虫 (小有名气)
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[交流]
如何让检测菌体的DNA或ATP含量 已有2人参与
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| 我想要1篇测量菌体DNA或ATP含量的详细的实验方法！希望各位大侠帮帮忙，有的可以发到我的邮箱，happyme198603@163.com |
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yangguoliguo
银虫 (小有名气)
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yanxiangru(金币+2,VIP+0): 虽然不是我想要的，但写这么多也有奖励 11-20 09:02
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电泳法测定ATP含量及影响因素的讨论 三磷酸腺苷二钠（ATP）为腺嘌呤核苷-5′-三磷酸酯二钠盐，由发酵法制得。由于ATP在生产中易带入ADP等杂质，在贮存中易分解成ADP等。ATP、ADP、AMP在紫外均有吸收，必须用纸层析或纸电泳先行分离洗脱后，再用紫外法测其吸收度，计算含量。若分离不好，实验因素控制不当，则影响其含量的测定。 ATP的含量测定，卫生部标准及地方标准的测定方法均采用纸电泳法分离，紫外分光法测定其吸收度，计算含量。但具体测定过程各地方标准测定条件有所不同，或与药典规定存在差异。虽有规定测定方法以最新版药典为依据，但如ATP片仍按各地方标准检验，还未上卫生部标准，在检验过程存在无所适从的情况，可能由于电泳法测定ATP含量过程影响因素较多之故。因此，基于共同探讨解决这个问题，通过日常工作中的经验积累总结，对ATP的含量测定过程作初步的总结。 1 实验部分 1.1 试液、缓冲液 0.01 mol／L盐酸液、1 mol／L甲酸液、枸橼酸盐缓冲液（pH 3.0）。 1.2 仪器和用具 紫外分光光度计、电吹风、水平式电泳仪、直流电源、色谱滤纸、容量瓶（10 ml）、具塞试管（20×100 mm)、刻度吸管、移液管（5 ml）、微量注射器、3号垂熔玻璃漏斗、紫外光灯（254 nm）。 1.3 仪器装置 参照《中国药典》1995年二部附录 1.4 操作法 1.4.1 试液、缓冲液 0.01 mol．L-1盐酸液量取盐酸0.9 ml，加水至1000 ml混匀。1 mol．L-1甲酸液取甲酸［98％（w／w 75.5 ml］，加水稀释至2000 ml。枸橼酸盐缓冲液（pH3.0） 取枸橼酸（C6H8O7．H2O）39.04 g与枸橼酸钠（C6H5N3O7．2H2O）4.12 g(均精确至0.01 g)加水4000 ml，使溶解，用酸度计调pH值至3.0。1.4.2色谱纸 取色谱滤纸置1 mol／L甲酸溶液中浸泡过液，次日取出用水漂洗至洗液pH值不低于4，置60℃烘箱烘干，备用，长度及大小根据电泳室的大小裁剪。1.4.3点样有湿法点样和干法点样。湿法点样：是将裁好的滤纸全部浸入枸橼酸盐缓冲液（pH3.0)中，湿润后，取出，用滤纸吸干多余的缓冲液，置电泳槽架上，使起始线靠近阴极端，将滤纸两端浸入缓冲液中，然后用微量注射器精密点加供试品溶液：每点10μl，共3点，并留2个空白位置；干法点样：是将供试品溶液点于滤纸上，吹干，再点，反复数次，直至点完规定量的供试品溶液，然后用喷雾器，将滤纸喷湿，点样处最后喷湿(本法适用于稀的供试品溶液)。1.4.4电泳于电泳槽中加入适量电泳缓冲液，浸没铂电极，接通电泳仪，稳压电源档，调整电压梯度为18～20 v／cm，电泳1 h 45 min，取出立即吹干，置紫外灯（254 nm）下检视，用铅笔划出紫色斑点的位置，跑在滤纸最前面的紫色斑点是ATP。1.4.5含量测定剪下供试品斑点和与斑点位置相近的空白滤纸，剪成细条，分别置试管中，各精密加入0.01 mol／L盐酸溶液5 ml，摇匀，放置1 h，用3号垂熔玻璃漏斗，滤过，也可用自然沉降或离心法倾取上清液，按各药项下的规定测定吸收度，并按吸收系数计算含量。 结果判断，2份样品的相对误差应不大于3％。 2 注意事项 2.1 点样位置在阴极 2.2 在不带电点样情况下，样品应在2～3 min内点完，立即开启电源进行电泳，否则造成斑点扩散，使测得的含量偏低。 2.3 用0.01 mol．L-1盐酸洗脱时，室温不宜过低，若室温低于15℃，可置25～30℃水浴中进行洗脱。 2.4 洗脱时，应不断振摇使洗脱完全，放置时间也不宜过长，否则，影响含量测定的稳定性。 2.5 微量注射器宜校正后使用。 3 讨论 由于操作过程影响因素较多，以下几点是作者在工作中的几点感受与大家共同探讨。 3.1 枸橼酸盐缓冲液离子强度和pH值的影响，M／20缓冲液（pH4.8）的分离效果（ADP泳动距离／ATP的泳动距离为0.89)和分离速度(电压梯度20 v／cm时为3.7 cm／h)，不及M／20缓冲液（pH3），后者分离效果为0.69，分离速度为6.5 cm／h。M／50缓冲液（pH 3）与M／20缓冲液（pH3）比较，前者斑点扩散。 3.2 层析滤纸经甲酸处理后，可除去纸中金属离子，使ATP、ADP、AMP的斑点集中，分离完全，且使滤纸的空白吸收值减小，有利于提高结果的精度。 3.3 采用湿法点样与干法点样，认为湿法带电点样，其斑点大小与分离效果均优于干法点样，测定结果平行性好。 3.4 电泳开始时，应立即在色谱纸上补充缓冲液，可避免因色谱纸上缓冲液过少，而影响斑点分离。 3.5 测定波长和吸收系数，按核酸类物质测定，习惯在260 nm的波长处测定吸收度，而不是在吸收峰处，可能会因分光光度计波长误差引起测定结果的差异，卫生部标准（1989年）采用的吸收峰处（257±1 nm）测定，可克服这一不足。 3.6 电压梯度，直接根据色谱纸的实际电泳长度按（18～20 v／cm）计算总电压，较好控制。 3.7 电泳时间，不宜过长，按卫生部标准规定为1 h 45 min，有的地方标准，ATP片电泳时间2.5 h，时间过长影响整个试验操作安排，而且电泳过程因电能转化，不断散热，可能也会影响结果，建议采取散热措施。 3.8 各地方标准统一情况，有的地方标准，仍与卫生部标准，不能统一，电泳时，如缓冲液pH为（4.8），测定波长为260 nm，E1%1 cm＝259，电泳时间为2.5 h，使得最后计算结果存在差异(与卫生部标准方法比较)。 参考文献 ［1］中国药典：二部，1995；附录28 ［2］中国药品检验标准操作规范/卫生部药政局：中国药品生物制品检定所编，北京，中国医药科技出版社，1996；6：352 ［3］中华人民共和国卫生部药品标准：抗生素生化药品注释，中华人民共和国卫生部药典委员会编，1990；69 检测菌体DNA 微生物生长的测定方法有多种，根据研究对象或目的选择。 (一)微生物细胞数目的检测方法 1．总细胞计数法 显微镜直接记数法和比浊法 (1)血球计数板法 血球汁数板中央有一个体积一定的计数室( 0.1mm3。将菌悬液或孢子悬液在显微镜下计数，然后再按一定公式计算出细菌总数。 (2)涂片计数法 将一定体积(0.1ml)的样品，均匀地涂在载片的一定面积内(1cm2。在显微镜下计算细胞数量，推算1cm2所含细胞数目。 （3）比浊法：菌体细胞培养液混浊，在一定范围内，菌体数量与浑浊成正比，故可通过分光光度计或比色计求出浑浊度，通过与标准曲线对比，求出样品中菌液浓度，算出个体数。 特点：所得结果包括死菌和活菌。 2. 活菌计数法（平板菌落记数法）： 是通过测定样品在培养基上形成的菌落数来间接确定其活菌数的方法．故又称平板计数法。 特点：计算的结果是活菌落。 注意：样品稀释度。一个活细胞形成一个菌落。 （1）涂布平板法 用灭菌的涂布器将一定体积(不大于0.1ml)的适当稀释度的菌液涂布在琼脂培养基的表面，然后保温培养有到菌落出现，记录菌落的数目并换算成每毫升试样中的活细胞数量。 （2）倒平板法 将样品稀释到一定浓度，取一定体积(0.1—1ml)倒入冷却至45℃的固体培养基混合，制成平板，培养后，出现菌落，由菌落数推算出的菌总数。 3 滤膜过滤法：样品同过微孔滤膜后，细菌收集在滤膜上，然后将滤膜放在培养基中培养，通过菌落计数求出样品活菌落。 (二)微生物生长量和生理指标的测定方法 测定微生物生长量及相关的生理指标，常用以下方法： 1．湿重法：将单位体积微生物培养液离心，收集沉淀物，然后再称重。 2．干重法：将离心得到的细胞沉淀物，置于100---105℃的烘箱中干燥过夜除去水分，然后再称重。 特点：适合与菌体浓度高的样品。表示菌体生长量。 3、测定细胞内菌种化学成分：方法难，操做困难，但较准确。 细胞内菌种化学成分多少（∝），反映群体中菌体数量的多少。 （1） 测定含氮量：N在细胞内稳定，测定总N量，粗蛋白=N*6.25g。 （2） 测定DNA：微生物细胞DNA含量稳定，采用荧光指示剂或染色剂与菌体DNA作用荧光比色或分光光度法测得DNA的含量。 （3） 其他生理指标：如测定碳、磷、RNA、ATP、DAP(二氨基庚二酸)的含量等。 (二)丝状微生物菌丝长度的测定方法 对于丝状微生物。特别是丝状真菌，通常是通过测定菌丝的长度变化来反映它们的生长速率。方法有： 1．培养基表面菌体生长速率测定法 主要测定一定时间内在琼脂培养基表面的菌落直径的增加值。 2．培养料中菌体速率测定法 主要测定一定时间内在固体培养料中菌丝体向前延伸的距离。 如：栽培食用菌的培养料。 3．单个菌丝顶端生长速率测定法 在显微镜下借助目镜测微尺测定在一定时间内单个菌丝的伸长长度。 |
yanxiangru
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