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药物毒理学中的肝脏损伤标志物
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前言 肝脏是机体代谢与解毒的核心器官，承担着白蛋白、凝血因子合成，葡萄糖的合成与储存，胆红素及胆固醇的利用与循环，激素代谢，以及各类药物的生物转化与解毒等多重生理功能。 药物诱导肝损伤（DILI）是过去 30 年间药物上市后撤出市场的主要原因之一。因此，在非临床安全性评估中合理选用肝损伤相关生物标志物，并对检测结果进行科学解读，是毒理从业者必须掌握的核心技能。 本文将对常见的肝损伤相关生物标志物进行简要介绍。 总论 目前临床常用的肝损伤相关标志物可分为两大类：肝细胞损伤标志物包括丙氨酸转氨酶（ALT）活性、天冬氨酸转氨酶（AST）活性、山梨醇脱氢酶（SDH）活性和谷氨酸脱氢酶（GLDH）；肝胆损伤标志物则包含碱性磷酸酶（ALP）活性、γ- 谷氨酰转移酶（GGT）活性、总胆红素（TBiL）、总胆汁酸（TBAs）以及 5’核苷酸酶。在所有血清学检测参数中，ALT、AST、ALP 和 TBiL 是应用频率最高的 4 项核心指标。 ALT ALT 主要分布于肝细胞胞浆内，肾脏、心肌、骨骼肌等组织中也有少量分布。它可催化丙氨酸与 α- 酮戊二酸之间的氨基转移反应，生成谷氨酸与丙酮酸。当肝细胞受损时，胞浆中的 ALT 会释放至细胞外，最终进入血液循环。仅 1% 的肝细胞发生破坏，就可使血清 ALT 水平升高一倍，因此该指标被世界卫生组织推荐为肝功能损伤最敏感的检测指标。 不过 ALT 的特异性存在局限：骨骼肌损伤同样会导致 ALT 水平上升；若肝损伤同时合并维生素 B12 缺乏，或受到吡哆醇 - 5’磷酸抑制剂的干扰，ALT 活性可能不会出现预期升高。因此在非临床安全性评价中，若无对应组织病理学结果支持，需满足血清 ALT 值超出正常上限 3 倍，且伴随另一项肝损伤生物标志物的显著异常，才可判定为存在肝损伤。 AST AST 可催化天冬氨酸与 α- 酮戊二酸之间的可逆氨基转移反应。和 ALT 类似，AST 不仅存在于肝脏中，骨骼肌等多种组织也有分布。肝细胞受损时，AST 会释放至胞外，进而引起血清 AST 活性升高；在非临床研究的常用实验物种中，骨骼肌损伤同样会导致 AST 活性上升。 由于 ALT 在血清中的半衰期更长，且 AST 更多结合于线粒体结构中，因此肝细胞损伤引发二者同步升高时，ALT 的升幅通常高于 AST。 此外，非临床安全性评价中，动物因固定束缚造成的轻度肌肉损伤，也可能引发 AST 水平升高。 GLDH 谷氨酸脱氢酶（GLDH）是一种定位于线粒体的酶，可介导谷氨酸与 α- 酮戊二酸的可逆转化。肝损伤发生时，血清 GLDH 活性会随之上升，相较于 ALT，其升高幅度更显著、持续时间更长。与 ALT 不同的是，血清 GLDH 活性既不受骨骼肌损伤的干扰，也不会受糖皮质激素诱导而发生变化。 但受限于当前检测试剂的可靠性不足，GLDH 目前尚未在非临床研究中作为常规检测指标使用。 SDH SDH 分布于多种组织中，可催化山梨醇与果糖的可逆氧化还原反应，过程伴随 NADPH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）的转化。对于啮齿类、犬类及非人灵长类动物而言，SDH 是急性肝细胞损伤的高敏感性、高特异性标志物。 不过 SDH 的血清半衰期较短（犬体内仅约 4 小时），和多数临床化学分析物相比稳定性有限，样本需在动物解剖后尽快完成检测，因此目前在非临床安全性研究中的应用较少。 总胆汁酸 TBAs 总胆汁酸在肝脏胆固醇代谢、肠道脂肪及脂溶性维生素吸收过程中发挥重要作用。循环中的胆汁酸水平会受进食、禁食状态的影响，而其水平异常升高，也可作为肝细胞损伤和 / 或肝功能改变的提示标志。 ALP 碱性磷酸酶（ALP）属于水解酶类，能够移除多种蛋白质、核苷酸分子上的磷酸基团。它是常用实验动物肝胆损伤的核心生物标志物之一，当发生胆管阻塞时，血清 ALP 水平会显著上升，因此在非临床与临床研究中，均作为胆汁淤积型肝损伤的指示指标。 和 ALT 类似，ALP 对肝胆损伤没有绝对特异性，骨骼生长、骨骼疾病、糖皮质激素治疗、微粒体酶诱导等情况，都可能导致 ALP 活性增加。在非临床研究中解读 ALP 波动需格外谨慎：啮齿类动物体内存在一种肠道来源的 ALP 亚型，禁食或厌食状态下该亚型水平下降，进食后则会短暂升高，会对整体检测结果产生干扰。 TBiL 总胆红素是衰老红细胞中血红蛋白的分解产物，由直接胆红素与间接胆红素共同组成。TBiL 升高通常提示胆汁淤积，但也可能由其他因素导致：比如红细胞破坏过多使胆红素生成增加、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶等代谢酶受抑制，或是肝脏整体功能下降。针对高胆红素血症相关的所有研究数据，通常需要进行全面综合的评估，才能明确 TBiL 升高的具体原因。 GGT γ- 谷氨酰转移酶（GGT）是一种分布于肝小管的酶，作为谷胱甘肽循环的组成部分，负责将谷氨酰基团转移至其他受体分子，除肝脏外也存在于其他组织中。胆汁淤积状态下，GGT 会因表达诱导而水平升高，可用于辅助验证胆汁淤积相关的 ALP 活性升高。在犬类中，GGT 是胆汁淤积的敏感标志，且特异性相对更强。 其他指标 由于 ALT 等现有肝损伤生物标志物存在特异性不足的问题，目前行业内正在持续探索特异性更强，且能够额外提供损伤区域、受累细胞类型相关信息的新型生物标志物。过去十年间，学术界筛选出了一批具备应用潜力的经典与新兴损伤标志物，等待进一步验证。第一组待验证的生物标志物包括 GLDH、苹果酸脱氢酶（MDH）、对氧磷酶 - 1（PON1）与嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）；第二组验证对象为 SDH、精氨酸酶 1（ARG-1）及谷胱甘肽转移酶（GSTa）；循环 microRNA 标志物 miR-122 则被纳入第三组待验证行列。 Luminex 与 MSD 两种多因子检测平台，分别适用于哪些毒理标志物检测场景？ 两种平台均是药物毒理生物标志物检测的主流技术，适配场景各有侧重： Luminex 平台：基于液相荧光编码微球技术，可灵活定制多因子组合 Panel，单样本可同步检测数十至上百种目标因子，通量高、样本用量少。非常适合肝脏损伤相关的多指标批量筛查，高效完成大样本量的毒理初筛研究。 MSD 平台：基于超敏电化学发光检测技术，具备更高的检测灵敏度与更宽的线性范围，针对低丰度的肝脏损伤特异性标志物，检测重复性与准确性更优，适配脑脊液、血清等微量样本的肝脏损伤验证研究。  |
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