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FFPE样本建库前的关键步骤：DNA片段化不应被忽视
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在肿瘤基因检测、靶向测序、全外显子测序以及回顾性临床研究中，FFPE样本是一类非常重要的样本来源。 FFPE样本经过福尔马林固定和石蜡包埋处理，能够较好地保存组织形态，便于病理诊断、样本归档和长期保存。因此，医院病理科、肿瘤研究队列和临床样本库中，积累了大量FFPE组织。这些样本不仅承载着丰富的临床信息，也为后续分子检测和疾病机制研究提供了重要基础。 然而，在NGS建库过程中，FFPE样本的DNA处理难度明显高于新鲜组织或血液等。部分样本虽然检测浓度符合要求，但建库产量并不理想；部分样本前期质控结果尚可，测序后却出现覆盖不均一、重复率偏高或有效数据不足等问题。甚至对于批量样本而言，不同样本之间的建库表现也可能存在较大差异，影响后续数据分析的稳定性。 这些问题并不一定只来源于提取或建库试剂。在FFPE样本的DNA前处理过程中，每环节都会影响最终结果，其中DNA片段化就是一个容易被忽视的重要步骤。 FFPE样本的难点，在于DNA质量的不确定性 与新鲜组织、血液等这些临床样本相比，从FFPE样本中提取的DNA状态比较复杂。 在福尔马林固定、石蜡包埋和长期保存过程中，DNA可能发生不同程度的降解，也可能存在交联、碱基损伤和片段分布不均等问题。不同组织类型、固定时间、保存年限和前处理条件，也都会进一步增加样本之间的差异。 因此，FFPE样本的难点并不只是DNA起始量低，更重要的是DNA质量不稳定。有些样本片段已经明显降解，有些样本仍然保留相对较长的DNA片段；有些样本浓度较高，但真正能够有效参与建库的模板有限。对于这些样本，如果前处理步骤控制不当，后续建库和测序结果就更容易受到影响。 这也是FFPE样本建库需要更加谨慎的原因。实验人员不仅需要关注DNA浓度，还需要关注DNA完整性、片段分布以及建库方案对插入片段长度的要求。 FFPE应先评估，再进行后续处理 由于FFPE样本之间存在明显质量差异，因此在进入建库流程前，不建议直接套用统一的处理参数。更合理的做法是先对样本进行质量评估，再根据样本状态和建库目标确定后续处理方案。 在常规实验流程中，DNA浓度和纯度通常都会进行检测。浓度检测可以帮助判断样本是否满足建库起始量要求；纯度检测则可用于评估样本中是否存在蛋白、盐离子、有机溶剂或其他杂质残留。这两项指标是建库前的基础判断，但对于FFPE样本来说，仅有浓度和纯度信息仍然不够。因为FFPE样本的DNA与其他类型样本的最大不同就是降解程度，所以我们更需要关注的是DNA片段分布情况。 FFPE样本中的DNA存在多种情况。比如，部分DNA片段本身已经较短，即使浓度和纯度符合要求，也未必适合继续进行常规强度的片段化处理。部分DNA没有降解，仍然是一个长的、完整的状态。部分既存在完整的长DNA片段，又存在部分弥散片段。这三种还只是比较常规的情况，而实际情况更为复杂。如果在不了解片段分布的情况下直接套用统一参数，可能会导致样本被过度打断，短片段比例进一步增加，进而影响后续文库质量。 如上图，同批次提取的DNA就有多种情况。 1. DNA片段相对完整（蓝色框）：有完整长片段，部分弥散状片段大于2000 bp。 2. DNA片段完整程度降低（绿色框）：有完整长片段，少量弥散状片段大于1000 bp。 3. DNA片段完整程度进一步降低（黄色框）：有完整长片段，弥散状片段主要在750 bp左右。 4. DNA片段弥散（红色框）：样本主要由弥散状片段组成，几乎没有可见的完整片段。 我们可以根据片段分布的情况来优化对应的打断参数。例如，1、2用一个打断参数，3用一个打断参数，4用一个打断参数，避免过度打断或片段化不足，使样本以更适合建库的状态进入后续流程。尤其是在肿瘤Panel、WES、WGS等应用中，DNA片段长度会影响文库插入片段范围、捕获效率、覆盖均一性和有效数据利用率。对于样本量有限、质量差异较大的FFPE样本来说，提前了解片段分布，有助于提高前处理流程的针对性和稳定性。 稳定、可控的片段化方式更适合FFPE样本 DNA片段化不足，可能影响接头连接、扩增效率和目标区域捕获效果；如果片段化过度，则可能进一步损失有限模板，增加短片段比例，影响文库质量和有效测序信息。所以对于质量差异较大的FFPE样本来说，前处理流程的稳定性是一个不可或缺的要求。 聚焦超声是一种常用于DNA片段化的物理方法。它通过声能作用于样本，使DNA发生随机断裂，从而获得一定范围内的目标片段。与依赖酶反应的片段化方式相比，超声片段化不依赖特定识别位点，在随机性和低序列偏好方面具有优势，更适用于对覆盖均一性和文库复杂度要求较高的应用场景。 同时，聚焦超声可通过调整处理时间、功率等参数，对片段分布进行优化。这种可调节、可重复的处理方式，有助于实验室根据不同FFPE样本质量和建库需求，建立更稳定的前处理流程。 |
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