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[交流] 单细胞转录组联合蛋白组检测：突破单一组学边界，重塑细胞分群精度

在单细胞生物学研究中，单细胞转录组测序（scRNA-seq）实现了在单个细胞水平解析基因表达谱的突破，是目前细胞异质性研究的主流手段。然而，仅依靠转录组信息难以完整定义细胞身份与功能状态 ——mRNA 表达水平与蛋白表达水平并非完全对应，且大量免疫细胞亚型的核心鉴定标志物为表面蛋白。在此背景下，单细胞转录组与蛋白组联合检测（如 CITE-seq、Ab-seq 技术路线）通过同时捕获单个细胞的转录组信息与数十种表面蛋白表达信号，实现了对细胞更精细、更准确的解析，其优势已在免疫研究、肿瘤微环境分析等领域得到充分验证。

一、单一单细胞转录组测序的技术瓶颈
单细胞转录组测序通过捕获细胞内 mRNA 信息构建基因表达谱，进而完成细胞分群与类型注释，但在实际研究中存在难以忽视的局限性：
（1）转录与蛋白表达不同步，无法直接反映细胞功能表型
mRNA 仅代表基因转录潜能，受翻译调控、蛋白降解、翻译后修饰等过程影响，其丰度与蛋白丰度并非线性对应。仅通过转录组推断细胞功能，易出现 “转录水平上调但蛋白未表达” 的误判，无法精准反映细胞的真实生理状态。

（2）低丰度标志物检测困难，稀有细胞易被淹没
许多关键细胞表面标志物的 mRNA 表达量极低（如部分分化抗原、细胞因子受体），受 scRNA-seq 检测灵敏度与捕获率限制，常出现 “基因检出为零但蛋白实际表达” 的情况，导致对应细胞亚群无法被正确识别。

（3）细胞分群分辨率不足，免疫细胞亚型易混杂
对于高度异质性的免疫细胞体系，许多亚群（如 γδ T 细胞、NKT 细胞、中性粒细胞亚群）的转录组差异极小，但表面蛋白组合特征差异显著。仅依靠转录组的 UMAP 分群往往只能划分大类，无法实现精细亚型拆分，甚至出现不同细胞类群边界模糊、混杂成簇的现象（如下图左侧单独转录组分群结果所示）。

单细胞转录组应用方向

二、单细胞转录 + 蛋白联合检测的技术实现路径
单细胞转录组与蛋白组联合检测的核心技术原理是寡核苷酸偶联抗体技术：将特异性抗体与一段带有独特条形码（Barcode）的 DNA 序列偶联，抗体与细胞表面蛋白结合后，其偶联的 DNA 条形码可与细胞内 mRNA 一同被单细胞测序平台捕获，最终同时获得每个细胞的转录组表达矩阵与蛋白表达矩阵。

在数据分析层面，目前主流采用加权最近邻（Weighted Nearest Neighbor, WNN）算法（如 Seurat 分析框架），对转录组与蛋白组两个维度的信息进行加权整合，生成 wnnUMAP 降维可视化结果。该算法会根据两组学的信息贡献度自动分配权重，既保留转录组的全基因组覆盖优势，又发挥蛋白组的细胞身份鉴定优势，最终输出更贴合细胞真实属性的分群结果。

针对 T 细胞等高度异质性的研究对象，可定制包含 30 种以上关键免疫标志物的蛋白 Panel，覆盖 T 细胞亚群、髓系细胞、固有淋巴细胞等多种类群的核心标志物，实现 “一次检测，双重维度，多重分群”。

单细胞蛋白组应用方向

三、从分群结果看联合检测的核心优势
通过对比单独单细胞转录组与 “转录组 + T 细胞 30 色蛋白” 的分群结果，联合检测的优势可直观体现在以下四个方面：
（1）细胞分群分辨率显著提升，稀有细胞类型精准捕获
左侧单独转录组 UMAP 中，仅能清晰区分 CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、NK 细胞、B 细胞、单核细胞等大类群，γδ T 细胞（gdT）、NKT 细胞、中性粒细胞（Neutrophil）等稀有或转录特征不显著的细胞类群无法独立成簇，常被混杂在其他细胞群中。
右侧联合检测的 wnnUMAP 结果中，新增了 γδ T 细胞、NKT 细胞、中性粒细胞等多个独立细胞簇，嗜碱性粒细胞、肥大细胞、浆样树突状细胞（pDC）、常规树突状细胞（cDC）等类群的边界也更加清晰。这意味着联合检测能挖掘出单一转录组会遗漏的稀有细胞亚群，还原更完整的细胞组成图谱。

（2）细胞身份注释更准确，降低注释错误率
单一转录组分群高度依赖 marker 基因的表达，易因基因检测 dropout、细胞状态波动导致注释偏差。而表面蛋白是细胞身份的 “金标准” 标志物，例如 CD4、CD8、CD3、CD19、CD14 等蛋白的表达是免疫细胞分型的核心依据。
联合检测通过 “转录组特征 + 蛋白标志物” 双维度交叉验证，可大幅提升细胞注释的准确性：既避免了 “转录本缺失导致的细胞误判”，也纠正了 “转录组相似但蛋白表型完全不同” 的细胞混杂问题。例如 T 细胞与 NKT 细胞在转录组层面相似度极高，但通过 CD3、CD56 等蛋白标志物可实现精准拆分。

（3）T 细胞亚群拆分更彻底，适配免疫研究核心需求
T 细胞是肿瘤免疫、自身免疫研究的核心对象，其亚群繁多且功能差异巨大。仅靠转录组难以精细区分 Naive T、效应 T、记忆 T、调节性 T 等功能亚群，也无法准确界定 CD4+ 与 CD8+ T 细胞的边界。
搭配 30 色 T 细胞定向蛋白 Panel 后，联合检测可基于 CD4、CD8A、CD45RA、CD45RO、CD25、CD69 等蛋白标志物的组合表达，直接对 T 细胞进行功能亚型划分，同时将 γδ T、NKT 等特殊 T 细胞亚群完全独立出来，为后续的免疫功能分析、克隆演化研究提供更精准的细胞基础。

（4）表型与基因型关联，实现功能机制双重解析
转录组反映细胞的基因调控状态与潜在功能，蛋白组反映细胞的即时表型与实际功能。联合检测可在单个细胞中同时关联两组学信息：既可以通过转录组分析细胞的信号通路活化、转录因子调控，又可以通过蛋白表达直接验证细胞的分化状态、活化程度、耗竭水平。
例如在肿瘤浸润淋巴细胞研究中，可同时获得 T 细胞的耗竭相关基因表达谱与 PD-1、TIM-3 等耗竭蛋白的表达量，实现 “机制 - 表型” 的双向验证，结论更具说服力。

四、联合检测的核心应用场景
（1）肿瘤免疫微环境研究：精准解析肿瘤浸润免疫细胞的亚群组成、活化状态与空间分布，为免疫治疗靶点筛选、疗效预测提供高分辨率数据。

（2）自身免疫疾病研究：精细区分外周血或病灶组织中 T、B 细胞亚群的失衡状态，揭示自身反应性淋巴细胞的表型特征。

（3）疫苗与感染免疫研究：追踪疫苗接种或病原体感染后，免疫细胞的活化、分化轨迹，验证抗原特异性细胞的蛋白表型与转录特征。

（4）血液系统疾病研究：解析造血分化过程中的细胞亚型异常，识别恶性克隆细胞的表面蛋白标志物与转录特征。

五、总结与展望
单细胞转录组测序开启了单细胞研究的时代，而转录组 + 蛋白组联合检测则进一步突破了单一组学的信息边界。从分群效果来看，联合检测不仅显著提升了细胞类型的分辨率，实现了稀有亚群的精准捕获，更通过双维度验证保障了细胞注释的准确性，让细胞分群从 “基于转录推断” 升级为 “转录 + 蛋白双重确认”。