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daifeng

银虫 (小有名气)

[交流] DNA提取的问题

求助各位虫友,本人提克雷伯杆菌N天了可是一直提不出来,我采用的是CTAB法,步骤如下:

1、过夜培养菌液取1.5毫升装EP管,12000转离心2MIN,弃菌液。
2、菌体加567微升TE,吹打使充分重悬。加30微升 10%SDS,3微升蛋白酶K,37度水浴一小时。
3、加100微升5M氯化钠,80微升CTAB/NaCL溶液,混匀,65度,水浴10MIN。
4、加等体积氯仿/异戊醇,混匀,12000转,离心5MIN。
5、留上清,加等体积的酚:氯仿,混匀,12000转,离心5MIN。
6、留上清,加0.6倍体积的异丙醇,轻轻颠倒混合至看到白色DNA沉淀析出
7、轻轻倒掉异丙醇,DNA沉淀用70%乙醇洗涤
8、12000转离心1MIN,倒掉乙醇,风干使乙醇挥干。
9、加50-100微升无菌水溶解DNA.

可是在第4步离心后,没有分层,只有白色的絮状沉淀悬浮。我加长离心时间也依然如此。不知哪位大侠能指点,不胜感激!
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xuezhen

银虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
第二步,我们一般用55度水浴的。
4楼2009-11-18 22:53:59
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09021122

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
问题很有可能出现在第二步:
最主要是要让菌体充分的破裂,放出DNA等。
建议还是充分的震荡EP管,使菌体全部破裂
雄关漫道真如铁,而今迈步从头越
2楼2009-11-18 22:01:59
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wlsky24

新虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
菌体没有充分裂解吧,我提的时候用液氮研磨后再进行的
3楼2009-11-18 22:32:43
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tutufei

铜虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
蛋白酶K最适55度吧,我用高盐法提的比CTAB的效果好
5楼2009-11-20 21:02:52
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