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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » DNA提取的问题
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daifeng

银虫 (小有名气)

[交流] DNA提取的问题

求助各位虫友，本人提克雷伯杆菌N天了可是一直提不出来，我采用的是CTAB法，步骤如下：

1、过夜培养菌液取1.5毫升装EP管，12000转离心2MIN，弃菌液。
2、菌体加567微升TE,吹打使充分重悬。加30微升 10%SDS,3微升蛋白酶K,37度水浴一小时。
3、加100微升5M氯化钠，80微升CTAB/NaCL溶液，混匀，65度，水浴10MIN。
4、加等体积氯仿/异戊醇，混匀，12000转，离心5MIN。
5、留上清，加等体积的酚：氯仿，混匀，12000转，离心5MIN。
6、留上清，加0.6倍体积的异丙醇，轻轻颠倒混合至看到白色DNA沉淀析出
7、轻轻倒掉异丙醇，DNA沉淀用70%乙醇洗涤
8、12000转离心1MIN，倒掉乙醇，风干使乙醇挥干。
9、加50-100微升无菌水溶解DNA.

可是在第4步离心后，没有分层，只有白色的絮状沉淀悬浮。我加长离心时间也依然如此。不知哪位大侠能指点，不胜感激！
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1楼 2009-11-18 21:39:15
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09021122

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
问题很有可能出现在第二步：
最主要是要让菌体充分的破裂，放出DNA等。
建议还是充分的震荡EP管，使菌体全部破裂
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雄关漫道真如铁，而今迈步从头越
2楼2009-11-18 22:01:59
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wlsky24

新虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
菌体没有充分裂解吧，我提的时候用液氮研磨后再进行的
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3楼2009-11-18 22:32:43
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xuezhen

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
第二步，我们一般用55度水浴的。
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4楼2009-11-18 22:53:59
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tutufei

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
蛋白酶K最适55度吧，我用高盐法提的比CTAB的效果好
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5楼2009-11-20 21:02:52
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