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linruxin

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[交流] WB没出来

我最近在做人尿FSH（约30KD）纯蛋白的WB，但还没做出来，不知是一抗还是其他问题，有做过的吗？

提供一下相关信息？谢谢！

上样3--800ng 每条泳道
转：PVDF膜，80V 2h
一抗：Santa 多抗（兔抗人）1：150-1：300
二抗：1：10000
ECL 曝光显影定影

结果，没有目的条带

[ Last edited by linruxin on 2009-11-16 at 09:47 ]

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1楼 2009-11-13 10:27:44

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linruxin

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有人能给个建议？谢谢！

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2楼2009-11-16 09:49:17

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lzhwin

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amisking(金币+4,VIP+0): 11-16 11:37

1、请按照抗体说明书上规定的稀释比例稀释抗体。楼主的二抗是进口的吗？稀释比例好高啊。

2、PVDF膜转膜前要用纯甲醇浸泡，否则转不上去。并且要注意在保质期内使用，否则也一样。

3、跑胶时点预染MARKER或者转膜后用立春红染色保证转膜没有问题。

4、转膜的时候注意降温，选择PVDF膜要注意孔径，孔径错误或者转膜时间过长可能会导致小蛋白被转穿。

5、ECL显色要按照说明书上的方法来做，不同的试剂盒方法不一样。楼主是用X光片压片曝光的吗？如果是请多压一会。也可以适当延长显影时间，因为现在天气冷了，反应的速度会变慢。

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3楼2009-11-16 10:03:06

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heismeng

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350784478(金币+2,VIP+0): 11-17 11:08

同意楼上的首先用prestained marker确保转膜成功
同时可以加个positive control确认你的抗体是否合适有效
如果有positive的band的话膜什么都没问题的话就说明你上的样品不是你的目的

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4楼2009-11-16 10:10:14

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linruxin

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引用回帖:

Originally posted by lzhwin at 2009-11-16 10:03:
1、请按照抗体说明书上规定的稀释比例稀释抗体。楼主的二抗是进口的吗？稀释比例好高啊。

2、PVDF膜转膜前要用纯甲醇浸泡，否则转不上去。并且要注意在保质期内使用，否则也一样。

3、跑胶时点预染MARKER或 ...

二抗是进口的，稀释度不高的了，在另一个蛋白上用了

其余操作跟你说的一样的

不过没有预染MARKER,普通marker ,但曝光后可见marher条带

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5楼2009-11-16 11:22:32

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