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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » WB没出来
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linruxin

金虫 (小有名气)

[交流] WB没出来

我最近在做人尿FSH（约30KD）纯蛋白的WB，但还没做出来，不知是一抗还是其他问题，有做过的吗？

提供一下相关信息？谢谢！

上样3--800ng 每条泳道
转：PVDF膜，80V 2h
一抗：Santa 多抗（兔抗人）1：150-1：300
二抗：1：10000
ECL 曝光显影定影

结果，没有目的条带

[ Last edited by linruxin on 2009-11-16 at 09:47 ]
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1楼 2009-11-13 10:27:44
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linruxin

金虫 (小有名气)
有人能给个建议？谢谢！
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2楼2009-11-16 09:49:17
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lzhwin

木虫 (正式写手)
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amisking(金币+4,VIP+0): 11-16 11:37
1、请按照抗体说明书上规定的稀释比例稀释抗体。楼主的二抗是进口的吗？稀释比例好高啊。

2、PVDF膜转膜前要用纯甲醇浸泡，否则转不上去。并且要注意在保质期内使用，否则也一样。

3、跑胶时点预染MARKER或者转膜后用立春红染色保证转膜没有问题。

4、转膜的时候注意降温，选择PVDF膜要注意孔径，孔径错误或者转膜时间过长可能会导致小蛋白被转穿。

5、ECL显色要按照说明书上的方法来做，不同的试剂盒方法不一样。楼主是用X光片压片曝光的吗？如果是请多压一会。也可以适当延长显影时间，因为现在天气冷了，反应的速度会变慢。
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3楼2009-11-16 10:03:06
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heismeng

金虫 (小有名气)
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350784478(金币+2,VIP+0): 11-17 11:08
同意楼上的 首先用prestained marker确保转膜成功
同时可以加个positive control确认你的抗体是否合适有效
如果有positive的band的话 膜什么都没问题的话 就说明你上的样品不是你的目的
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4楼2009-11-16 10:10:14
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linruxin

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lzhwin at 2009-11-16 10:03:
1、请按照抗体说明书上规定的稀释比例稀释抗体。楼主的二抗是进口的吗？稀释比例好高啊。

2、PVDF膜转膜前要用纯甲醇浸泡，否则转不上去。并且要注意在保质期内使用，否则也一样。

3、跑胶时点预染MARKER或 ...

二抗是进口的，稀释度不高的了，在另一个蛋白上用了

其余操作跟你说的一样的

不过没有预染MARKER,普通marker ,但曝光后可见marher条带
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5楼2009-11-16 11:22:32
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mourning

木虫 (正式写手)
★
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原因太多，找个高手带你走一次吧
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6楼2009-11-16 13:03:47
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qqsvery

木虫 (著名写手)
★
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你是自己摸索还是有师兄带？建议让师兄看着你做一遍，看操作上有么有问题！
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谎言和真实在河边洗澡，谎言先洗好，穿走了真实的衣服，真实却不肯穿谎言的衣服。后来人们眼里只有穿着真实衣服的谎言，却很难接受赤裸裸的真实。
7楼2009-11-16 13:40:38
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mourning

木虫 (正式写手)
★
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转膜是什么仪器，电压似乎太高，时间太长
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8楼2009-11-16 14:25:43
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linruxin

金虫 (小有名气)
都是自己做的了，另一个蛋白同样做的，挺好，怀疑是一抗不结合
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9楼2009-11-17 10:56:33
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violet77277

铜虫 (初入文坛)
★
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用恒定电流要好一点，本人认为
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10楼2009-11-17 11:27:12
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