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WB实验蛋白提取步骤(通俗易懂版)
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Western Blot(WB)是检测特定蛋白质的常用实验技术,以下是不同样本的蛋白提取详细步骤,操作简单好上手:

一、贴壁细胞(以6孔板为例)

1.?倒掉培养板里的培养基,加预冷的PBS(能洗掉血清和死细胞),轻轻晃一晃洗涤后,再把PBS倒掉。注意:全程要在冰上操作,避免蛋白变质。
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2.?再加少量PBS,用细胞刮或灭菌枪头来回刮取细胞,把刮下来的细胞液体小心吸到空的EP管里。1500转/分钟离心5分钟,倒掉上层的液体(上清)。
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3.?往管里加100-200微升预冷的细胞裂解液(按磷酸酶抑制剂:蛋白酶抑制剂:裂解液=1:1:100的比例配)。小技巧:如果后续蛋白浓度不够,可适当多加一点蛋白酶抑制剂。
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4.?放在冰上裂解30分钟,之后在4℃环境下,12000转/分钟离心20分钟。
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5.?小心吸取上层的清液到新的EP管中,放在-20℃或-80℃冰箱保存,之后就能用啦。

二、悬浮细胞

1.?把培养瓶/板里的细胞小心吸到离心管中,1500转/分钟离心10分钟,倒掉上层上清。
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2.?加预冷的PBS,用枪轻轻吹打均匀,再以1500转/分钟离心5分钟,倒掉上清。
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3.?用滤纸吸干管里剩下的少量PBS,加100-200微升预冷的细胞裂解液,放在冰上静置30分钟。之后在4℃环境下,12000转/分钟离心20分钟。
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4.?小心吸取上层清液到新的EP管,记下吸取的液体量,放在-20℃或-80℃冰箱保存备用。

三、动物组织

1.?从-80℃冰箱取出组织样本,立刻放到冰上。用电子天平称取30-50毫克左右的组织块。
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2.?把组织块放进2毫升离心管,同时在管里放2-3个小研磨珠,再加入300微升裂解液。
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3.?用组织匀浆器研磨(参数参考:60赫兹运行15秒,停30秒,重复5次,不同组织可适当调整)。
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4.?研磨后管里会有很多泡沫,把离心管放到4℃冰箱静置15-20分钟。
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5.?在4℃环境下,12000转/分钟离心20分钟,吸取上层清液到新的离心管,放在-20℃或-80℃冰箱保存备用。

关键注意事项

整个提取过程一定要保持低温(冰上或4℃环境),防止蛋白降解;实验时的温度、时间、试剂比例要严格把控,这样才能保证后续实验结果准确。

WB实验蛋白提取步骤(通俗易懂版)

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2025-11-27 13:52   回复  
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重新启3楼
2025-11-27 14:22   回复  
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2025-11-27 14:29   回复  
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ekeyan5楼
2025-11-27 14:41   回复  
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