WB实验蛋白提取步骤（通俗易懂版） - 分子生物 - 核酸提取

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Western Blot（WB）是检测特定蛋白质的常用实验技术，以下是不同样本的蛋白提取详细步骤，操作简单好上手：

一、贴壁细胞（以6孔板为例）

1.?倒掉培养板里的培养基，加预冷的PBS（能洗掉血清和死细胞），轻轻晃一晃洗涤后，再把PBS倒掉。注意：全程要在冰上操作，避免蛋白变质。
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2.?再加少量PBS，用细胞刮或灭菌枪头来回刮取细胞，把刮下来的细胞液体小心吸到空的EP管里。1500转/分钟离心5分钟，倒掉上层的液体（上清）。
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3.?往管里加100-200微升预冷的细胞裂解液（按磷酸酶抑制剂:蛋白酶抑制剂:裂解液=1:1:100的比例配）。小技巧：如果后续蛋白浓度不够，可适当多加一点蛋白酶抑制剂。
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4.?放在冰上裂解30分钟，之后在4℃环境下，12000转/分钟离心20分钟。
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5.?小心吸取上层的清液到新的EP管中，放在-20℃或-80℃冰箱保存，之后就能用啦。

二、悬浮细胞

1.?把培养瓶/板里的细胞小心吸到离心管中，1500转/分钟离心10分钟，倒掉上层上清。
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2.?加预冷的PBS，用枪轻轻吹打均匀，再以1500转/分钟离心5分钟，倒掉上清。
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3.?用滤纸吸干管里剩下的少量PBS，加100-200微升预冷的细胞裂解液，放在冰上静置30分钟。之后在4℃环境下，12000转/分钟离心20分钟。
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4.?小心吸取上层清液到新的EP管，记下吸取的液体量，放在-20℃或-80℃冰箱保存备用。

三、动物组织

1.?从-80℃冰箱取出组织样本，立刻放到冰上。用电子天平称取30-50毫克左右的组织块。
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2.?把组织块放进2毫升离心管，同时在管里放2-3个小研磨珠，再加入300微升裂解液。
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3.?用组织匀浆器研磨（参数参考：60赫兹运行15秒，停30秒，重复5次，不同组织可适当调整）。
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4.?研磨后管里会有很多泡沫，把离心管放到4℃冰箱静置15-20分钟。
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5.?在4℃环境下，12000转/分钟离心20分钟，吸取上层清液到新的离心管，放在-20℃或-80℃冰箱保存备用。

关键注意事项

整个提取过程一定要保持低温（冰上或4℃环境），防止蛋白降解；实验时的温度、时间、试剂比例要严格把控，这样才能保证后续实验结果准确。