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细胞周期和ROS数据图分析
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1 什么是流式直方图 流式直方图是流式细胞术中最基本的单参数数据展示形式，它反映的是单个参数在整个细胞群中的分布情况。比如，这群细胞的大小。 下图，横坐标（X轴）代表荧光信号或散射光信号的强度，从左到右信号逐渐增强。纵坐标（Y轴）代表检测到的细胞数量，通常用事件数目表示。 当流式细胞仪检测到一个细胞时，就记录为一个事件（event），这个细胞的荧光强度决定它在X轴上的位置。比如，下图，荧光强度弱的细胞会落在X轴左侧，反之在右侧。 如果大量细胞具有相似的荧光强度，就会在对应位置形成峰。峰代表具有相似信号强度的细胞群体，峰的位置反映信号强弱，峰的高度反映该群体细胞的多少。 流式直方图本质上是一种统计直方图，当统计的细胞数量足够大时，原本的柱状图形会变成平滑的曲线。 接下来我们以几个经典实验应用去详细解析流式直方图。 2 ROS（活性氧）水平检测 活性氧是细胞代谢的副产物，它的水平升高与细胞氧化应激密切相关。 流式细胞术采用荧光探针（如DCFH-DA）检测ROS水平。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由进入细胞。 细胞内酯酶将其水解为DCFH，DCFH被ROS氧化为有荧光的DCF，荧光强度与ROS水平成正比。 下面这张数据图，作者通过检测细胞内活性氧水平，评估Tempol处理是否能抑制顺铂诱导的ROS水平升高。 下图显示了四组细胞的ROS水平，X轴为FL1通道的荧光强度，与ROS水平成正比；Y轴为细胞数量。 每种颜色的曲线分别代表不同处理组，黑色曲线为未处理的对照组，红色曲线为顺铂处理组，蓝色曲线为Tempol处理组，绿色曲线为顺铂+Tempol处理组。 根据曲线位置可以得知： 未处理组（黑色）和Tempol处理组（蓝色）的ROS水平基本一致，处于较低水平（X轴位置靠左，荧光强度较低）。 顺铂处理组（红色）的ROS水平最高（X轴位置最右，荧光强度最强），说明顺铂处理后细胞的氧化应激程度最高，导致细胞损伤。 顺铂+Tempol处理组（绿色）的ROS水平比单纯顺铂处理组有所降低（X轴位置比顺铂组靠左，荧光强度减弱），说明顺铂+Tempol处理可以显著降低顺铂诱导的ROS水平升高。 3 细胞周期检测 细胞周期分析也是流式直方图的经典应用之一。 它的检测原理基于细胞周期各时相DNA含量不同：G0/G1期具有二倍体DNA含量（2N），G2/M期具有四倍体DNA含量（4N），S期DNA含量介于二者之间。 下面这张图利用流式细胞术分析了对照组细胞与划痕后12小时修复细胞的细胞周期分布。 X轴为DNA染料的荧光强度，反映DNA含量，而因为DNA含量是连续倍数的关系（2N、4N），所以我们X轴必须用线性坐标（lin）来显示。Y轴为细胞数目，峰越高，代表处于该DNA含量的细胞数目越多。 从图可以得知： 左侧最高且最窄的峰（红色），代表DNA含量为二倍体（2N）的细胞，包含G0期和G1期细胞。 右侧矮峰（蓝色），荧光强度是G0/G1峰的2倍（X轴数值是G0/G1峰数值的2倍），代表DNA含量为四倍体（4N）的细胞，包含G2期和M期细胞。 连接两个峰之间的“平台”（斜线），代表DNA含量从2N向4N过渡的细胞，也就是S期细胞。这个区域是一个连续分布，没有明显的峰，需要通过软件（如ModFit）拟合计算细胞比例。 左右两张图对比，修复细胞的G0/G1期细胞比例降低，而S期和G2/M期细胞比例增加，表明修复细胞的细胞周期发生了从G0/G1期向S期和G2/M期的转变。 4 CFSE增殖检测 CFSE（羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯）染色法是一种检测细胞分裂的有效方法。 CFSE是一种可透过细胞膜的荧光染料，CFSE的前体CFDA-SE本身不发荧光，但进入细胞后，其乙酸基团会被细胞内酯酶去除，从而使生成的CFSE分子具有荧光性。 CFSE又与细胞内蛋白共价结合，细胞分裂时CFSE平均分配到子代细胞中，荧光强度减半，从而评估细胞分裂的次数。 下图是圈选小鼠体内CD45.1+/CD8+细胞进行CFSE分析的数据图。 在右侧的CFSE增殖曲线中，X轴为CFSE的荧光强度，Y轴这里作者用最大百分比（%ofMax）代替了细胞数量，让我们能够更容易到观察峰形的变化。 在右侧直方图中，我们可以看到： 最左侧又高又宽的峰（深灰色）是未标记CFSE的对照组，在X轴上呈现CFSE阴性(位于X轴左侧）。 最右侧又高又细的峰（浅灰色）是CFSE标记但未刺激的实验组，在X轴上呈现CFSE荧光强度最强（位于X轴最右侧）。由于未进行刺激处理，所以细胞尚未发生增殖分裂，只有一个峰。 中间波浪形的曲线（黑色曲线）是CFSE标记且刺激后的实验组，呈现出连续的、波浪型的多个峰，说明细胞发生了多次增殖分裂。 随着细胞分裂，CFSE荧光染料被平均分配到两个子细胞中，导致每个子细胞的荧光强度减半，图中每个峰作者分别标记了0、1、2......6： 0：未分裂的细胞，荧光强度最强。 1：分裂一次的细胞，荧光强度为父代（0）的一半。 2：分裂两次的细胞，荧光强度为“1”的一半，“0”的四分之一。 以此类推，可以得知图上CFSE标记的刺激组细胞分裂了六次。 毕合生物(www.bihebio.com)提供服务内容：分子生物学、免疫, 重组蛋白及ELISA相关、活性小分子化合物、高端化学、材料化学、细胞资源库与培养相关、生命科学、天然产物 |
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