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仿生蚕丝蛋白修饰，开发出具有卓越机械性能和长期生物分子稳定性的即时可溶解微针
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一、 背景 从蚕丝蛋白中获得的可溶解微针 （DMN） 被认为是最有前途的，因为它们的蚕丝基质具有生物相容性、可调节的机械性能和卓越的生物分子稳定性能，这是治疗性生物分子和疫苗的无冷链储存和运输所必需的。然而，具有优异机械性能和出色储存稳定性（在 4 °C 和 25 °C 下）的丝基速溶微针 （DMN） 的需求尚未得到满足。本文首次通过在丝素蛋白分子中引入羧基来限制它们的分子内和分子间相互作用、构象变化和在更高浓度下形成β片，从而改善丝素蛋白的溶解度，从而应对这些挑战。这种在改性丝 （MS） 中富集羧基的仿生方法通过限制其卷曲到β片转化，可实现 >10% 至 25% w/v 的更高溶解度。此外，它还允许制备具有更高浓度的MS（>10% w/v至20% w/v）和稳定剂（>5% w/v）但具有优异的机械性能（>0.4 N）和基质中生物分子的稳定性的蚕丝DMN。在不同温度下长期储存，MS-DMN的瞬间溶解性也不受影响。 二、 研究内容 在这项研究中，我们首次通过对丝素蛋白分子进行羧基修饰来限制其分子间和分子内相互作用，从而通过低粘度增强其溶解度来阻碍卷β片的形成。与UMS相比，改性丝（MS）有助于制备稳定剂浓度超过10% w/v的MS-DMN和MS-T-DMN，如图1所示。不同MS及UMS样品的核磁共振谱图，证实丝绸经羧基修饰。UMS与MS的FTIR光谱，表明丝绸的羧基修饰通过降低分子间作用力阻碍了卷曲-螺旋相变。UMS与MS的SDS凝胶电泳图谱显示，MS因引入羧基与SDS产生静电排斥作用，导致电泳迁移率降低。UMS的圆二色谱显示222 nm处出现更高负峰（对应β-片层），而MS在198 nm处出现负峰（对应随机卷曲/α-螺旋）。MS10、MS15、MS20及UMS10在室温储存90天后的溶解度变化：因卷曲-β片层相变导致凝胶化，但同等浓度的MS20仍保持液态。这种仿生改性方法有助于控制蚕丝蛋白中的线圈-β片转变，这有利于制备具有高机械强度的微针。 图1 丝素蛋白的修饰 选择MS与稳定剂（海藻糖、蔗糖）联合作为基质，制备MS稳定剂（MS-T）复合微针，以稳定生物分子。图2 CD光谱显示，MS-DMN在198 nm处具有较高的负峰，对应于无规则线圈/α螺旋，而UMS4.5-DMN在222 nm处显示较高的负峰，对应于β片。MS20-DMN的CD光谱包含不同的稳定剂浓度（5%、7.5%、10% w/v），在198 nm处显示出较高的负峰，表明存在随机卷曲/α螺旋。UMS中游离氨基和羟基的羧基修饰可以通过抑制β片的形成来减少链间或链内氢键，可能有助于MS-DMN在室温下的储存。 图2 MS稳定分子之间的分子相互作用 图3表明，MS20-DMN、MS15-DMN、MS10-DMN和UMS4.5-DMN表现出快速溶解性，而UMS4.5-DMN-RT90在插入20%明胶凝胶中时不溶解。将MS-DMN和MS-T-DMN在室温下储存，MS-DMN在25 °C下储存6个月后，在5 min内仍保持完整的形态和溶解性，但UMS-DMN变脆且容易破损。研究了 SSD-MS-DMN 药物的离体皮肤渗透性，并与 UMS-DMN 进行了比较。不同比例的MS-DMN和UMS4.5-DMN在施用后5 min内SSD的累积释放量均超过100%。相比之下，UMS4.5-DMN-RT90在5 min内分别低于15%，表明UMS4.5-DMN-RT90的二级结构从随机卷曲变为β片，导致凝胶化，导致UMS4.5-DMN-RT90药物释放缓慢。 图3 MS-DMN的物理形态、崩解和体外释放 微针的机械坚固性对于其成功渗透到皮肤中至关重要。DMN 中的水分会削弱其机械性能，并通过改变其蛋白质构象来减少其瞬间溶解，最终导致皮肤渗透性差。MS-DMN 能够有效穿透皮肤并输送有效载荷。然而，微针基质中蛋白质浓度越低或稳定剂浓度越高，断裂力越小。鉴于稳定生物分子需要更高浓度的海藻糖，分析了海藻糖的百分比，发现即使在PRP-SSD-MS20-DMN中海藻糖的浓度增加5-10% w/v后，断裂力也从每个贴片的82 N降低到48 N，并且将其浓度增加到10% w/v以上会导致微针在制造和处理后难以脱模。所有含有5%w/v海藻糖的MS-DMN制剂的猪皮穿透深度均超过300 μm，而UMS4.5-T5-DMN制剂的渗透深度仅为10 μm。 图4 DMN的机械性能 载有稳定剂的各种蚕丝DMN贴片的生物相容性如图5所示，用各种微针对HEK293细胞进行24和48小时的活死染色图像，显示所有MS-DMN组的细胞活力超过70%。HEK293细胞的肌动蛋白鬼笔环肽染色和DAPI与微针孵育24和48 h，表明所有MS-DMN组均显示出完整的细胞形态。用MTT测定法定量分析与HEK293细胞孵育的各种微针的生物相容性，各组均无细胞毒性；溶血测定表明，所有样品，无论MS-DMN中的海藻糖或SSD，都表现出最小的红细胞死亡。 图5 MS-DMN的生物相容性和生物安全性 本研究旨在通过与优化的MS稳定剂混合并在不同温度下储存，提高PRP/HRP作为加载在DMN中的模型生物分子的稳定性，如图6所示。当在4°C下储存一个月时，PRP-MS20-T5-MN组表现出超过80%的HRP活性，在25°C下储存超过6个月时表现出70%的相对HRP活性（图6A）。当添加稳定剂时，由于氢键和玻璃状基质形成的协同作用，HRP稳定性进一步提高。进一步探索了使用另一种生物分子（PRP）的稳定作用，并观察到与HRP相似的生物活性保留模式。在25 °C下储存6个月后释放的PRP与未储存的DMN无显著差异，所有PRP-MS20-T5-DMN-（0,1,2,3,6）的增殖率均超过95%，优于48 h内58%的MS20-T5-DMN。 CAM 测定是几种功能测定之一，为研究血管生成和转移提供了一种易于使用且适应性强的动物模型。如图6E所示，目前的工作使用卵内CAM测定法评估了PRP在不同温度下储存6个月后在DMN中的生物活性和储存稳定性。结果表明MS20-T5-DMN可以在4 °C和25 °C下维持PRP活性6个月。 图6 MS-DMN中生物分子的储存稳定性以及卵细胞血管生成研究 具体来说，解决生物分子不稳定性的方法包括加入更高浓度的稳定剂，以降低生物分子在干燥或脱水过程中的迁移率。在40°C和75%相对湿度下储存30天时，与5% w/v海藻糖（85%）相比，10%w/v海藻糖（95%）更好地保留了富血小板血浆（PRP）的生物活性（图7）。 图7 与在25 °C下储存一个月的PRP负载MS20-T5-DMN相比，在40 °C、75%相对湿度下储存PRP负载的MS20-T5-DMN的加速生物活性评估 使用糖尿病伤口愈合模型评估 SSD-PRP-MS20-T5-DMN （6 个月）处理和储存应激后 PRP 的生物活性。SSD-PRP-MS20-T5-DMN具有抗氧化剂SSD的瞬间释放、沉积的ECM样MS和PRP的独特组合，有助于成纤维细胞募集和胶原沉积，促进伤口愈合，因此显示出更好的治疗效果。 图8 体内研究 三、 总结与展望 使用>5% w/v的蚕丝和稳定剂制备的传统蚕丝微针依靠β片感应赋予高机械强度来刺穿角质层，但由于β片的疏水性质而失去了即时溶解性。总之，我们报道了一种独特的蚕丝修饰仿生方法（MS），模拟蚕丝蛋白（>20% w/v）储存在味精管腔中，以在限制β片生长的情况下实现卓越的溶解度。制备的MS-DMN贴片显示出瞬间溶解性和优异的机械强度>45 N，超过了目前大多数可用的丝基DMN，而不会诱导β片的形成。此外，由于分子间/分子间相互作用减少，MS-DMN即使在25 °C下长期储存后仍会崩解，而这在未修饰或天然的丝基DMN中难以控制。MS20-T5-DMN在4 °C和25 °C下保存6个月时，可保留70%以上的PRP和HRP活性，在较高温度（40 °C、75% RH）下保存1个月，可保留90%以上的PRP和HRP活性。PRP的生物活性在MS-DMN中保留，并在体内显示出有效的伤口愈合率。这种仿生方法为制备具有高机械强度的丝基DMN提供了一种解决方案，而不会诱导β片形成，以及一个在室温下稳定生物分子的平台。MS-DMN的初步评估表明，它在室温下为PRP提供了更好的储存稳定性6个月以上;因此，我们正在利用模型抗原将其在疫苗递送应用中的潜力转化为可能。 原文链接：https://doi.org/10.1039/d4tb02836h |
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