| 查看: 140 | 回复: 0 | ||
[交流]
用于止血的含钽介孔生物活性玻璃粉末
|
|
介绍 止血是对血管损伤的一种高度调控和复杂的反应，需要血管壁、血小板和凝血蛋白的成分来有效地止血。通常分为原发性止血和继发性止血，原发性止血包括损伤后的血管反应，随后是血小板粘附、活化和聚集。当内皮下基质蛋白暴露在损伤的血管壁中时，血小板粘附并激活，导致血小板表面被称为整合素αIIbβ3的蛋白受体的构象变化。血液中的配体，如纤维蛋白原（和其他蛋白质）与整合素αIIbβ3受体结合，并连接活化的血小板。这将导致血小板聚集和血小板堵塞的形成，以防止受损者的出血。继发性止血与原发性止血同时发生，涉及凝血级联的内在和外在途径中的因素的激活。内在途径是由因子XII（FXII）启动的，而外在途径是由组织因子（TF）-因子VII（FVII）复合物启动的。这些途径汇聚到共同的凝血途径，形成一个纤维蛋白网络，稳定血小板堵塞，进一步防止出血。 生物活性玻璃（BGs）和介孔BGs（MBGs）被认为是止血剂，因为它们的材料特性：高表面积，玻璃表面效应（如下解释），一个负的表面电荷和Ca2+离子的提供。一个较大的表面积，在数百m2g-1的范围内，有助于吸收血液中的液体成分，在损伤部位聚集凝血因子，激活凝血的内在途径。由于氧原子和金属原子之间的电负性差异，眼镜也有一个极性表面，这种极性增强了血液在与它们接触时的凝固能力。这种效应被称为“冰川效应”，通过增强内在凝血途径发挥作用。此外，带负电荷的表面激活FXII，增强凝固的内在途径；通过测量水介质中的zeta电位（ZP）来记录材料的表面电荷。 将Ta（0~10mol%）加入Si-Ca-P MBG中，生成一系列含钽的MBGs（Ta-MBGs），并研究其对物理、化学的影响并测定了止血性能。选择Ta作为掺杂剂，以增强Si-Ca-P MBG固有的止血性能，因为氧化钽具有抗菌和抗炎特性。氧化钽粉已被提出用于止血，但其作为Si-Ca-P MBG中的掺杂剂来增强硅酸盐MBG的止血。在Ta含量低时，这些Ta-mbg表现出六边形介孔纳米结构，但随着Ta增加到1 mol%以上，有序六角形通道开始出现不连续；被认为是非桥接氧增加（玻璃系列中Ta mol%的增加）和Ta与其他MBG组分热膨胀系数不匹配的结果。 含10mol% Ta的Ta-MBGs对介孔有序通道的破坏最大，导致表面积和孔隙体积减小。本研究中纳入的初步小动物模型采用小鼠尾出血模型，证实了Ta-MBGs的止血潜力；与“不治疗”相比，测量的使用显著减少了出血时间（平均出血时间的≥50%）。 实验 材料 采用试剂级三嵌段共聚物P123聚（乙二醇）嵌段聚（丙二醇）嵌段聚（乙二醇）、硝酸钙（≥99.0%)、磷酸三乙酯（≥99.8%，TEP)、正硅酸四乙酯（98%，TEOS）、钽(V)乙氧基（99.98%）和乙醇。用蒸馏水将试剂级盐酸（盐酸）稀释至0.5N。 Ta-MBG的组成（mol%）。 合成 如表1所示，通过增加乙醇钽（V）含量合成了MBGs，但牺牲了TEOS。钙和磷的加入增加了生物活性，在整个系列中保持不变。 在适量的TEOS中加入1ml0.5N盐酸，放在一边进行水解起始。在一个单独的烧杯中，将4克P123和1.4克四水合硝酸钙溶解在76 ml乙醇中。加入含P123和四水硝酸钙的乙醇溶液，在乙醇溶液中加入0.68mlTEP和x mol%钽(V)乙醇，最后在混合物中加入TEOS-HCl溶液。将溶液覆盖并搅拌过夜，然后将溶液转移到培养皿中进行蒸发诱导自组装（EISA）。使用EISA，该溶液在大约一周内转化为凝胶。将衍生凝胶在650℃下以1℃min-1的加热速率煅烧6小时将煅烧玻璃研磨碎，并通过45μm网筛分。所有进一步的分析都在筛过的粉末上进行。 Zeta电位测量 使用zeta电位分析仪测量BGs的ZP。稀释的聚苯乙烯胶乳溶液用作校准材料，去离子水用作分散介质。将约2.5毫克样品分散在10毫升去离子水中。将分散的样品注入一次性折叠式毛细管池进行ZP测量。每个样品运行n=3次，每次实验重复三次，报告平均ZP（平均值的标准误差）。 溶血试验 在测试中，向含有2.5毫克样品（n 5）的微量离心管中加入500μL血液。将试管轻轻倒置4-5次，使粉末与血液充分混合。试管在37℃孵育60分钟；孵育后，将试管以2500 G离心10分钟以收集上清液血浆。将含有200毫升血浆和1800毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS）的比色皿置于UV-3600 UV-VIS- NIR分光光度计中，记录540 nm处的吸光度。试管中的PBS用作基线，而“无处理”组用作对照。吸光度值与最佳拟合线相关联，以获得百分比溶血值。报告获得的溶血百分比的平均值（平均值的标准误差）。 凝血化验 分别测定凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（APTT）来评价Ta-MBGs对外源性和内源性凝血途径的影响。 PT测量外源性和共同凝血途径的活性。它代表在抗凝血液中加入组织因子、磷脂和钙后形成纤维蛋白凝块所需的时间。 APTT测量固有和共同coag途径的活性。 细胞毒性分析 在牛成纤维细胞上进行标准MTT测定以分析Ta-MBG样品的细胞毒性（n=6）。成纤维细胞分离自12-18月龄小牛的掌腕关节中央韧带。结果与不含Ta-MGB的相同培养物进行了比较。 统计分析 所有定量结果均表示为平均值的平均标准误差。使用单向方差分析和Tukey事后检验对收集的数据进行统计分析，以进行后续的成对比较。显著性由小于0.05的p值定义。 结果 Zeta电位 图1中绘制的测量结果显示，所有样品都显示出负ZP。与0Ta样本相比，0.5Ta的ZP上升至-20.4 mV，但其余样本下降。 样本的ZP测量值表示为平均值的平均标准误差。所有值均为负值，一般值随Ta含量的增加而增加。 溶血试验 溶血（不需要的红细胞溶解）可以通过测量540 nm处的吸光度变化来进行光度测定，因为红细胞溶解后血浆显示血红蛋白水平升高。进行该试验是为了确定Ta-MBGs不必要的溶血。与“未处理”和最重掺杂的钽-MBG 10Ta相比，大多数样品组（0Ta、0.5Ta、1Ta和5Ta）的溶血百分比在统计上显著降低（图2）。将Ta含量从5摩尔%增加到10摩尔%会提高溶血百分比。虽然“未处理”和10Ta的溶血百分比相似，但其他样品减少了不必要的溶解程度 样品平均值的溶血百分比标准误差。吸光度值与校准曲线相关，得到溶血百分比。*和#分别表示与10Ta和10Ta相比，0Ta、0.5Ta、1Ta和5Ta的溶血百分比降低有统计学意义（p<0.05）。 凝血化验 与“未处理”玻璃、1Ta玻璃和10Ta玻璃相比，5Ta玻璃的APTT预期有统计学上的显著降低（图3（a））。0Ta样品也与“未治疗”相比，显示出统计学上显著的APTT减少（图3（a））。测试表明5Ta的性能优于其他材料（图3（a））。与0Ta相比，5Ta的PT也出现了意想不到的统计学显著降低（图3（b））。 样品的APTT (a)和PT (b)结果。每个标记代表一个单独的测试；该图显示了平均值的平均次数标准误差。3a.与“未治疗”（***p=0.0008）、1Ta（**p=0.005）和10Ta（*p=0.04）组相比，APTT显著降低（n=7-9，p<0.05）。此外，与“未治疗”组相比，0Ta组的APTT水平降低有统计学意义（n=7-9，p<0.05）。3b.与0Ta组（*p=0.01）相比，5Ta组的PT降低有统计学意义（n=6-9，p<0.05）。 细胞毒性分析 MTT法分析Ta-MBGs对牛成纤维细胞的细胞毒性。获得的数据用于推断ta- MBGs的Ta掺杂增加（0Ta、0.5Ta、1Ta、5Ta和10Ta之间的比较）和Ta-MBGs质量增加（同一组中1、3和5 mg）对细胞生存力的影响。图4显示了溶解的甲晶体在570 nm处的吸光度；晶体吸光度的降低表明成纤维细胞代谢活性的降低。在样本组中未发现统计学上的显著差异，这意味着在Si-Ca-P组合物中添加Ta不会影响细胞活力。 MTT分析。图显示了ta-mbg对牛成纤维细胞的细胞毒性分析。细胞毒性分析以570 nm处平均（n=6）的平均吸光度标准误差表示。差异差异无统计学意义。 结论 Ta-MBGs具有止血潜力，因为与未治疗相比，它们显示出高度负的ZP值、低溶血潜力和降低的APTT。Ta-MBGs存在下的细胞活力似乎不受Ta含量的影响。通过ZP、APTT和PT测量证实了Ta- MBGs的止血能力，并通过细胞毒性和溶血分析证明了其安全性。尽管10Ta样品具有高度阴性的ZP，但它们会引起溶血且不会降低APTT。然而，0Ta和5Ta样品改善了凝血功能，ZP值为负，APTT和溶血减少。对于5Ta样品，由于Si-O网络中存在更多的非桥氧，负ZP有助于激活凝固的内在途径，从而降低APTT。从这些体外试验模型可以确定，5 mol% Ta- MBGs的物理特性是所评估的实验材料中最有效的止血剂。 |
回复此楼
