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ap372767129铁虫 (正式写手)
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[求助]
各位老师，我遇到了一个构建ppic9k毕赤酵母表达载体的问题
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各位老师，有个问题想请教一下。我近期在做将一个目的基因构建到ppic9k表达载体中，用同源重组的方式将目的基因和载体连接起来。但是在转化大肠杆菌DH5α感受态后，氨苄抗性平板上没有阳性克隆，有时只长零星的菌落，挑取活化很困难，测序结果也不对。换了STBL3感受态转化也不行。这个目的基因能够正常构建到pET系列载体中，并且能够正常在大肠杆菌中表达，现在因为课题需要将目的基因构建到ppic9k载体中，在转大肠杆菌筛选正确的转化子就一直失败。之前构建其他两个蛋白的基因到ppic9k载体上，能成功，测序也正常，确定不是操作的问题，也不是载体和目的基因序列错误的问题。想问一下，出现这个问题的原因可能是什么，有什么办法可以解决？我现在想到用同源延伸PCR方法直接获得有目的基因的线性化载体，这样可行吗？ @biostar2009@飞约疯人院@wizardfan@youlinglyw |
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这个可以从以下几个方面解决。 第一是质粒ppic9K是不是突变了，如果插入位点是一样的，可以选择之前构建的2个正确的ppic9K作为出发质粒，重新把片段整合进去。 第二个更常见一些， 就是你用的连接酶失活了，导致连接不上，你计算好骨架和片段的摩尔比，重新连接一次，如果还是连接不上，可以直接更换新的连接酶。可以先找人借一次反应需要的酶，重新连接一次。 第三个也挺常见的，感受态失活了，和第二条一样，你找人借连接酶重新连接后，可以找人再借一只感受态，和你的感受态一起转化，看看是不是你的感受态失活了。 第四个，你提到同源延伸PCR，应该说的是gibson组装。现在很多公司都在卖一步克隆试剂盒，还有同源重组试剂盒，可以试试看，效果挺好的。只是连接后需要测序验证，没有突变。 |
2楼2025-11-25 15:42:56