| 查看: 1401 | 回复: 1 | ||
| 【悬赏金币】回答本帖问题，作者ap372767129将赠送您 200 个金币 | ||
ap372767129铁虫 (正式写手)
|
[求助]
各位老师，我遇到了一个构建ppic9k毕赤酵母表达载体的问题
|
|
各位老师，有个问题想请教一下。我近期在做将一个目的基因构建到ppic9k表达载体中，用同源重组的方式将目的基因和载体连接起来。但是在转化大肠杆菌DH5α感受态后，氨苄抗性平板上没有阳性克隆，有时只长零星的菌落，挑取活化很困难，测序结果也不对。换了STBL3感受态转化也不行。这个目的基因能够正常构建到pET系列载体中，并且能够正常在大肠杆菌中表达，现在因为课题需要将目的基因构建到ppic9k载体中，在转大肠杆菌筛选正确的转化子就一直失败。之前构建其他两个蛋白的基因到ppic9k载体上，能成功，测序也正常，确定不是操作的问题，也不是载体和目的基因序列错误的问题。想问一下，出现这个问题的原因可能是什么，有什么办法可以解决？我现在想到用同源延伸PCR方法直接获得有目的基因的线性化载体，这样可行吗？ @biostar2009@飞约疯人院@wizardfan@youlinglyw |
回复此楼» 猜你喜欢
Tosylate-DPA-714介导¹⁸F-DPA-714 PET成像的前沿进展
已经有0人回复
-
I-BRD9: BRD9溴结构域化学探针，BET选择性>700倍
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有183人回复
-
莫那利珠单抗阻断NKG2A/HLA-E抑制通路 | Biochempartner
已经有0人回复
-
GSPT1口服分子胶降解剂MRT-2359 | Biochempartner
已经有0人回复
-
碳青霉烯类抗生素为何需联用西司他丁钠？ | Biochempartner
已经有0人回复
-
源自蕨类植物的抗炎美白活性分子去甲氧基荚果蕨素 | Biochempartner
已经有0人回复
-
肠道里的"代谢开关"：Fexaramine用肠道限制性重新定义 FXR 激动剂
已经有0人回复
-
DMXAA：从血管破坏剂到STING通路研究的关键工具分子 | Biochempartner
已经有0人回复
-
靶向PD-L1的人源化单克隆抗体阿特珠单抗
已经有0人回复
-
"探针之父"(+)-JQ-1如何改变表观遗传研究 | Biochempartner
已经有0人回复
U晋宝银
捐助贵宾 (正式写手)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 1960.4
- 散金: 4388
- 红花: 8
- 帖子: 921
- 在线: 101.4小时
- 虫号: 3109394
- 注册: 2014-04-02
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
|
这个可以从以下几个方面解决。 第一是质粒ppic9K是不是突变了，如果插入位点是一样的，可以选择之前构建的2个正确的ppic9K作为出发质粒，重新把片段整合进去。 第二个更常见一些， 就是你用的连接酶失活了，导致连接不上，你计算好骨架和片段的摩尔比，重新连接一次，如果还是连接不上，可以直接更换新的连接酶。可以先找人借一次反应需要的酶，重新连接一次。 第三个也挺常见的，感受态失活了，和第二条一样，你找人借连接酶重新连接后，可以找人再借一只感受态，和你的感受态一起转化，看看是不是你的感受态失活了。 第四个，你提到同源延伸PCR，应该说的是gibson组装。现在很多公司都在卖一步克隆试剂盒，还有同源重组试剂盒，可以试试看，效果挺好的。只是连接后需要测序验证，没有突变。 |
2楼2025-11-25 15:42:56