应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 单酶切遇到问题了 请指教
51/1返回列表
查看: 615  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

playboy723

金虫 (正式写手)

[交流] 单酶切遇到问题了 请指教

向各位虫友请教一个问题
我目前正在构建载体   设计的是用EcoR1单酶切连接进表达载体中   可是现在我目的基因已经扩出来了   酶切也挺成功    可是就是连不进去   我发现原因主要在表达载体上   我用EcoR1切开载体后按照常规用CIAP进行载体去P    可是发现载体自连的非常严重   感觉CIAP根本没有效果似的   满满的板子上都是自连的克隆（我连续做了几次都是如此）   所以我想请教下大家   看有没有单酶切做的好的虫友  遇到我的这些问题该怎么办   望不吝赐教    这个载体已经构建很长时间了  我都快失去耐心了   大家帮帮忙  谢谢

[ Last edited by 350784478 on 2009-11-14 at 11:57 ]
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2009-11-10 15:48:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

断弦的琴

铁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
不用了
帮忙是应该的 呵呵

至少在 载体自连 和片断竞争 就小多了
赞一下(1人) 回复此楼
不知道失去了多少以后我们能不再痛苦,不知道偿多少冷暖以后我们能看破生命.
7楼2009-11-10 19:51:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答

断弦的琴

铁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+3,VIP+0):谢谢交流 11-10 17:12
去磷酸化要控制好时间，不要以为做了去磷酸化这个实验，就是真的去了磷酸化。
给2个建议：
1, l磷酸化的时候按照试剂说明书上时间 分别延长和缩短，这样就有3个梯度。电泳检测，因为去P时间过头了 载体条带会变小的。
2，连接的时候 减少载体的浓度，增加片段的浓度。不一定分要1：5~1：10.  1：100都酶问题的。你现在不是怕长不出菌落是 怕长得太多，所以载体尽可能的少，片段尽可能的多。
赞一下(7人) 回复此楼
不知道失去了多少以后我们能不再痛苦,不知道偿多少冷暖以后我们能看破生命.
2楼2009-11-10 16:07:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

playboy723

金虫 (正式写手)
我是按照说明上做的    37°或者50°半小时   使用的是Takara的酶   你的意思是处理的时间长了   载体条带变小？   这个我倒真没注意过    这是怎么回事呢   有解释吗？   
我现在怀疑的是是不是CIAP对粘性末端的酶去P效果都不好呢？  因为我以前用CIAP处理EcoRV切过的末端效果就很好   基本没有自连的克隆     这又是怎么一回事呢？   知道的高手解释一下   谢谢了
赞一下 回复此楼
3楼2009-11-10 16:31:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

断弦的琴

铁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+3,VIP+0): 11-10 19:28
我以前做过的，也是用Takara 的。你可以 37度 15分钟 半小时 一小时 做三个梯度。建议不用50度的。
载体变小是因为去磷酸化是个连续的过程，当过了某一个最佳时间后 CIAP会继续向前去磷酸化，这样导致DNA片段局部降解。和对照一起跑个电泳，选取片段正确的。

我认为37度 半小时就可以。 那是好久前做的了 呵呵
赞一下(21人) 回复此楼
不知道失去了多少以后我们能不再痛苦,不知道偿多少冷暖以后我们能看破生命.
4楼2009-11-10 17:27:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] filecode +5 cratir 2026-08-14 9/450 2026-08-14 12:25 by 医学老男孩
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊 +10 Tide man 2026-08-10 11/550 2026-08-14 10:30 by 沁言学术
[基金申请] filecode +15 documentary 2026-08-10 17/850 2026-08-14 10:08 by kissu88
[基金申请] FileCode能看出啥？ +10 要乐观耀哥 2026-08-10 32/1600 2026-08-14 09:37 by 要乐观耀哥
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +10 家与远方 2026-08-10 15/750 2026-08-14 02:08 by 绵羊哥哥
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +9 majunge000 2026-08-10 12/600 2026-08-13 23:20 by iwuli
[硕博家园] 一作与独作在应聘高校教师时区别大吗 +3 mbygzh 2026-08-08 4/200 2026-08-13 19:31 by 龙-樱
[基金申请] 静等基金结果 +8 gjjjzhong 2026-08-10 21/1050 2026-08-13 17:56 by 且听虎啸
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +22 Lanmanbaby 2026-08-09 36/1800 2026-08-12 22:50 by sdfapple719
[基金申请] 奇怪，两个人的filecode固定段从头到尾一模一样 +7 布布和一二 2026-08-10 10/500 2026-08-12 09:12 by 布布和一二
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 确定了，国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
[基金申请] 2026国自然放榜时间 +9 布布和一二 2026-08-08 9/450 2026-08-10 11:22 by xxxx2020
[基金申请] 这样的filecode谁见过 +11 布布和一二 2026-08-08 22/1100 2026-08-10 11:10 by wmfsnow
[基金申请] 关于filecode +4 布布和一二 2026-08-07 7/350 2026-08-07 22:55 by zhanghaozhu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭