应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 单酶切遇到问题了 请指教
51/1返回列表
查看: 520  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

playboy723

金虫 (正式写手)

[交流] 单酶切遇到问题了 请指教

向各位虫友请教一个问题
我目前正在构建载体   设计的是用EcoR1单酶切连接进表达载体中   可是现在我目的基因已经扩出来了   酶切也挺成功    可是就是连不进去   我发现原因主要在表达载体上   我用EcoR1切开载体后按照常规用CIAP进行载体去P    可是发现载体自连的非常严重   感觉CIAP根本没有效果似的   满满的板子上都是自连的克隆（我连续做了几次都是如此）   所以我想请教下大家   看有没有单酶切做的好的虫友  遇到我的这些问题该怎么办   望不吝赐教    这个载体已经构建很长时间了  我都快失去耐心了   大家帮帮忙  谢谢

[ Last edited by 350784478 on 2009-11-14 at 11:57 ]
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2009-11-10 15:48:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

断弦的琴

铁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
不用了
帮忙是应该的 呵呵

至少在 载体自连 和片断竞争 就小多了
赞一下(1人) 回复此楼
不知道失去了多少以后我们能不再痛苦,不知道偿多少冷暖以后我们能看破生命.
7楼2009-11-10 19:51:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答

断弦的琴

铁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+3,VIP+0):谢谢交流 11-10 17:12
去磷酸化要控制好时间，不要以为做了去磷酸化这个实验，就是真的去了磷酸化。
给2个建议：
1, l磷酸化的时候按照试剂说明书上时间 分别延长和缩短，这样就有3个梯度。电泳检测，因为去P时间过头了 载体条带会变小的。
2，连接的时候 减少载体的浓度，增加片段的浓度。不一定分要1：5~1：10.  1：100都酶问题的。你现在不是怕长不出菌落是 怕长得太多，所以载体尽可能的少，片段尽可能的多。
赞一下(7人) 回复此楼
不知道失去了多少以后我们能不再痛苦,不知道偿多少冷暖以后我们能看破生命.
2楼2009-11-10 16:07:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

playboy723

金虫 (正式写手)
我是按照说明上做的    37°或者50°半小时   使用的是Takara的酶   你的意思是处理的时间长了   载体条带变小？   这个我倒真没注意过    这是怎么回事呢   有解释吗？   
我现在怀疑的是是不是CIAP对粘性末端的酶去P效果都不好呢？  因为我以前用CIAP处理EcoRV切过的末端效果就很好   基本没有自连的克隆     这又是怎么一回事呢？   知道的高手解释一下   谢谢了
赞一下 回复此楼
3楼2009-11-10 16:31:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

断弦的琴

铁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+3,VIP+0): 11-10 19:28
我以前做过的，也是用Takara 的。你可以 37度 15分钟 半小时 一小时 做三个梯度。建议不用50度的。
载体变小是因为去磷酸化是个连续的过程，当过了某一个最佳时间后 CIAP会继续向前去磷酸化，这样导致DNA片段局部降解。和对照一起跑个电泳，选取片段正确的。

我认为37度 半小时就可以。 那是好久前做的了 呵呵
赞一下(21人) 回复此楼
不知道失去了多少以后我们能不再痛苦,不知道偿多少冷暖以后我们能看破生命.
4楼2009-11-10 17:27:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 求调剂 +5 苦命人。。。 2026-04-18 6/300 2026-04-19 12:04 by 手机用户
[考研] 327求调剂 +27 Xxjc1107. 2026-04-13 30/1500 2026-04-19 08:22 by cuisz
[考研] 320求调剂 +5 深郊akm 2026-04-17 5/250 2026-04-18 19:52 by 王珺璞
[考研] 297，工科调剂? +5 河南农业大学-能 2026-04-14 5/250 2026-04-18 15:17 by Equinoxhua
[考研] 260求调剂 +4 Zyt1314520.. 2026-04-17 5/250 2026-04-18 08:28 by babysonlkd
[考博] 申博/考博 +3 啃面包的小书虫 2026-04-17 4/200 2026-04-17 23:54 by 阳阳阳^_^
[考研] 化工学硕294分，求导师收留 +33 yzyzx 2026-04-12 37/1850 2026-04-17 23:00 by wunaiy88
[考研] 304求调剂 +7 castLight 2026-04-16 7/350 2026-04-17 20:05 by 关一盏灯cd
[考博] 求博导｜生物质基多孔碳/超级电容方向，已有相关成果，寻能源材料/碳材料方向老师 +3 猪猪人Zzz 2026-04-12 3/150 2026-04-17 19:10 by 阳阳阳^_^
[论文投稿] 有没有接收比较快的sci期刊呀，最好在一个月之内的，研三孩子求毕业 20+4 之护着 2026-04-16 5/250 2026-04-17 10:02 by bobvan
[考研] 26药学专硕105500求调剂 +6 喽哈加油 2026-04-13 7/350 2026-04-16 14:31 by zhouxiaoyu
[基金申请] RY：中国产出的科学垃圾论文，绝对数量和比例都世界第一 +7 zju2000 2026-04-14 18/900 2026-04-16 11:36 by 欢乐颂叶蓁
[考研] 药学求调剂 +14 喽哈加油 2026-04-14 16/800 2026-04-16 10:15 by beilsong20
[考研] 085404 22408 309分求调剂 +9 lzmk 2026-04-14 10/500 2026-04-15 20:02 by 学员JpLReM
[考研] 通信工程求调剂！！！ +6 zlb770521 2026-04-14 6/300 2026-04-15 20:00 by 学员JpLReM
[考研] 各位老师好，求调剂，本科211，一志愿天津大学生物与医药学硕，差两名录取。 +11 路六六jjj 2026-04-13 11/550 2026-04-14 16:01 by zs92450
[教师之家] 转长聘了 +7 简单化xn 2026-04-13 7/350 2026-04-14 14:50 by xindong
[考研] 105500药学求调剂 +4 x_skys 2026-04-12 4/200 2026-04-14 13:37 by rndfc
[考研] 2026硕士调剂_能动_河南农业大学 +4 河南农业大学-能 2026-04-12 4/200 2026-04-13 22:01 by bljnqdcc
[考研] B区0809 ，数一英一，290 求调剂 +3 泠潍1111 2026-04-12 4/200 2026-04-13 20:35 by 学员JpLReM
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭