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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 单酶切遇到问题了 请指教
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playboy723

金虫 (正式写手)

[交流] 单酶切遇到问题了 请指教

向各位虫友请教一个问题
我目前正在构建载体   设计的是用EcoR1单酶切连接进表达载体中   可是现在我目的基因已经扩出来了   酶切也挺成功    可是就是连不进去   我发现原因主要在表达载体上   我用EcoR1切开载体后按照常规用CIAP进行载体去P    可是发现载体自连的非常严重   感觉CIAP根本没有效果似的   满满的板子上都是自连的克隆（我连续做了几次都是如此）   所以我想请教下大家   看有没有单酶切做的好的虫友  遇到我的这些问题该怎么办   望不吝赐教    这个载体已经构建很长时间了  我都快失去耐心了   大家帮帮忙  谢谢

[ Last edited by 350784478 on 2009-11-14 at 11:57 ]
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1楼 2009-11-10 15:48:43
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断弦的琴

铁虫 (小有名气)
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1949stone(金币+3,VIP+0):谢谢交流 11-10 17:12
去磷酸化要控制好时间，不要以为做了去磷酸化这个实验，就是真的去了磷酸化。
给2个建议：
1, l磷酸化的时候按照试剂说明书上时间 分别延长和缩短，这样就有3个梯度。电泳检测，因为去P时间过头了 载体条带会变小的。
2，连接的时候 减少载体的浓度，增加片段的浓度。不一定分要1：5~1：10.  1：100都酶问题的。你现在不是怕长不出菌落是 怕长得太多，所以载体尽可能的少，片段尽可能的多。
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2楼2009-11-10 16:07:53
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playboy723

金虫 (正式写手)
我是按照说明上做的    37°或者50°半小时   使用的是Takara的酶   你的意思是处理的时间长了   载体条带变小？   这个我倒真没注意过    这是怎么回事呢   有解释吗？   
我现在怀疑的是是不是CIAP对粘性末端的酶去P效果都不好呢？  因为我以前用CIAP处理EcoRV切过的末端效果就很好   基本没有自连的克隆     这又是怎么一回事呢？   知道的高手解释一下   谢谢了
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3楼2009-11-10 16:31:24
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断弦的琴

铁虫 (小有名气)
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amisking(金币+3,VIP+0): 11-10 19:28
我以前做过的，也是用Takara 的。你可以 37度 15分钟 半小时 一小时 做三个梯度。建议不用50度的。
载体变小是因为去磷酸化是个连续的过程，当过了某一个最佳时间后 CIAP会继续向前去磷酸化，这样导致DNA片段局部降解。和对照一起跑个电泳，选取片段正确的。

我认为37度 半小时就可以。 那是好久前做的了 呵呵
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4楼2009-11-10 17:27:06
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playboy723

金虫 (正式写手)
哦   学习了  以前还真不知道   谢谢啊   呵呵
那你认为CIAP正确处理粘性末端后就完全不能自连了吗？   我有一个想法就是粘性末端即使去P后也是突出的末端去P       那两个粘末端的其他碱基（除了末端碱基外）完全可以凭借碱基配对互补而使载体自连到一起   这样的话即使末端碱基由于去P而没连到一起   但转化后大肠杆菌后完全可以弥补这一缺陷     现在的单碱基突变方法不就是利用了这种方法吗      你觉得这样可以解释的通吗？   欢迎探讨
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5楼2009-11-10 19:21:14
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playboy723

金虫 (正式写手)
另外我想给你10个金币   谢谢你的讨论   该怎样给你呢？   我不会
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6楼2009-11-10 19:23:22
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断弦的琴

铁虫 (小有名气)
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不用了
帮忙是应该的 呵呵

至少在 载体自连 和片断竞争 就小多了
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不知道失去了多少以后我们能不再痛苦,不知道偿多少冷暖以后我们能看破生命.
7楼2009-11-10 19:51:53
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