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evoforever

铁虫 (小有名气)

[交流] 请问:如何去除total RNA中的钉子DNA?

由于要做RT-PCR,我们用Trizol提的细菌total RNA,但是分别用NEB, Promeg和TaKaRa的无RNAase的DNAase处理后,样品做普通PCR都能扩出阳性的条带来(负对照的水没有),说明DNA除不干净(但用总DNA做对照发现DNAase活性都还是很好的)。感觉头都大了。

据说细菌的total RNA确实很难除DNA,大家都有什么好的办法请给个建议。谢了先!!

[ Last edited by 350784478 on 2009-11-14 at 11:57 ]
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红多多

木虫 (正式写手)

版筑饭牛的日子

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1949stone(金币+2,VIP+0): 11-10 17:13
一般都是加DNase处理DNA
你用DNase处理DNA以后处理了DNase没有啊?不处理的话cDNA就完了……
处理DNase可以用酚抽提法,麻烦,RNA回收率低。我们实验室用的就是E.Z.N.A. TM Total RNA Kit 效果还可以。那个试剂盒的说明书上说EDTA高温灭菌也可以,没玩过,不予评价

附上说明书
http://www.omegabiotek.com.cn/ok ... 071211144441109.pdf
可以用QQ找我……
2楼2009-11-10 16:00:16
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ljwei_163

金虫 (正式写手)

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1949stone(金币+2,VIP+0):谢谢交流 11-10 17:14
会不会跟你的引物有关系?
因为你的引物结合区在基因的表达区,所以会P出带来?
共同讨论下,呵呵
3楼2009-11-10 16:29:54
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evoforever

铁虫 (小有名气)

没试过试剂盒,估计不行了可以尝试一下下。

我们是用无RNAase的DNAase处理,加热失活DNAase后,先用普通PCR跑一遍,看看里面会否有DNA污染(这样做会有问题吗?)。如果只有mRNA而没合成第一链cDNA,从道理上说用ORF设计的引物应该不会有PCR阳性扩增结果吧?

正式的实验里负对照当然用的是不加RT酶的total RNA。
4楼2009-11-10 17:39:13
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