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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 基因克隆到pCAMIBA1300
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36678293

铜虫 (正式写手)

[交流] 基因克隆到pCAMIBA1300

请教各位：


我的一个基因（1.5kbp）想克隆到pCAMBIA（12kbp，kan）上，但是做了好多次链接，就是连不上去，PCR双酶切链接试过了，基因从T载体上切下在链接也试过了，但是就是不长斑，感受态的效率也没问题，XL-GOLD的，10的8次方的效率应该有；链接酶试过SOLITION 1，和T4, 链接体系10ul和20ul都试过了，载体与片段的比例1：1--1：10都做过了。

可是就不是不知道什么原因，在这里请教大家了。。。。


不懂的不要留言，谢谢！！！

[ Last edited by 36678293 on 2009-11-9 at 19:34 ]
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1楼 2009-11-09 19:33:22
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zjwang

木虫 (正式写手)
遇到类似的问题，关注中
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2楼2009-11-09 20:08:45
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
★ ★ ★ ★
36678293(金币+1,VIP+0):谢谢！！！ 11-9 21:34
amisking(金币+3,VIP+0): 11-10 08:23
lz很辛苦哈~
帮你顶个帖

偶根据自己和别人的经验，废话几句
12k+1.5k的不算小啊，或许你那些不同的搭配里面有最佳的组合，也许并不是那些未知的原因导致链接失败，有可能是确实本身效率很低~~~
偶的导当年连6k+12k的，连了俩月，最终还是成功了~最终也没发现新的原因~重复而已~~~
废话几句，别介意

ps一句，适当降低kan的浓度，或许会好点

[ Last edited by scelab on 2009-11-9 at 21:31 ]
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小木虫之有关部门负责人
3楼2009-11-09 21:27:51
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changes

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+5,VIP+0): 11-10 08:23
Kana平板长斑吗？若是长斑但是验证不是的话，那就是1300载体酶切开。
若是Kana平板不长斑，1300空载体也不长的话，就是培养有问题了。
个人认为还是1300载体双酶切有问题，导致连接不上。
是分步酶切还是同时双酶切？建议单酶切试试。另外挑斑时多挑几个。10个就差不多了。
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4楼2009-11-09 22:46:12
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36678293

铜虫 (正式写手)
是，分步酶切
1300空载体的单菌落数量10的4-5次方（质粒1ul，感受他10ul）

链接产物一个班都不长！！！
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5楼2009-11-10 00:08:46
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
引用回帖:
Originally posted by changes at 2009-11-9 22:46:
Kana平板长斑吗？若是长斑但是验证不是的话，那就是1300载体酶切开。
若是Kana平板不长斑，1300空载体也不长的话，就是培养有问题了。
个人认为还是1300载体双酶切有问题，导致连接不上。
是分步酶切还是同时双 ...

貌似做植物的用这质粒比较多
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小木虫之有关部门负责人
6楼2009-11-10 00:22:29
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断弦的琴

铁虫 (小有名气)
★ ★ ★
amisking(金币+1,VIP+0): 11-10 08:23
36678293(金币+2,VIP+0): 谢谢！！1 11-10 16:44
pBI121也有类似的问题！

先把Kan抗生素的浓度降低　，２５ug/ml．试试．转化的效率可能不高，质粒又很大．多弄点感受态试下．复苏后离心把菌全涂了．
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不知道失去了多少以后我们能不再痛苦,不知道偿多少冷暖以后我们能看破生命.
7楼2009-11-10 08:21:02
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changes

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
amisking(金币+3,VIP+0): 11-30 12:42
引用回帖:
Originally posted by 36678293 at 2009-11-10 00:08:
是，分步酶切
1300空载体的单菌落数量10的4-5次方（质粒1ul，感受他10ul）

链接产物一个班都不长！！！

酶切片段和酶切载体都琼脂糖检测过吧？若没有问题。
那就可能是连接的问题了，换个T4连接酶试试，然后再做几个连接体系的比较。试试看吧。另外，连接时片段和载体的浓度别太高，回收时用水溶解，酶切回收片段别用EB溶解。
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8楼2009-11-10 10:59:17
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36678293

铜虫 (正式写手)
很期盼做做植物的同行予以解答，小弟在此先谢过了！！！
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9楼2009-11-10 16:47:04
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litao852

★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 11-30 12:42
首先再确定一下载体的位点，碱基没问题。
多做几个梯度，就是几个浓度的组合。
检查卡纳的浓度。
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10楼2009-11-10 19:32:38
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