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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 基因克隆到pCAMIBA1300
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铜虫 (正式写手)
同样的平板，正对照加10ul感受态长一满平板，单菌落都看不到。。。

载体双酶切，可以切下条带！！！
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11楼2009-11-11 00:02:51
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jiangnanxuetong

金虫 (小有名气)
首先 看看载体酶切是否有问题！
然后在连接过程中，尝试几种不同比例连接 试试！
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12楼2009-11-11 10:19:27
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36678293

铜虫 (正式写手)
13楼2009-11-13 08:59:21
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xnn
。。。。。。。。。。。。。。。。。。。
14楼2009-11-13 12:32:07
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jojojet

新虫 (初入文坛)
★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 11-30 12:42
问题一样，我的载体是pcam1301 目的条带1.7kb

大家努力。
往多交流 邮件 guizhouliuwei@163.com
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15楼2009-11-13 22:49:44
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jojojet

新虫 (初入文坛)
我连上了，但是是反向连接。楼主的怎么样了？
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16楼2009-11-29 23:58:20
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lzhwin

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+5,VIP+0): 11-30 12:44
首先想问楼主一个问题，1300是双元载体用于植物转基因。但是上面并没有启动子和终止子楼主的连接的片段上已经有启动子和终止子了吗？就我所知的很多有启动子的中间载体（PRT104  PUCCRNAi）都是通过一步单酶切连入1300的，楼主用的是什么中间载体呢？另外1300是可以通过蓝白斑筛选的。

1300上的酶切位点应该都是可以通过一步双酶切切开的，建议还是多检查酶切的相关试剂有没有污染，感受态细胞的情况好不好。1300载体比较大，转化率是会低一些，不行就重新做感受态吧。我们实验室还出过一次很恶心的问题：抗生素坏了。不行就借别人的kan试一下吧
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17楼2009-11-30 12:27:10
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lzhwin

木虫 (正式写手)
这么快就评价了？还没说完呢。楼主转化的时候涂了多少感受态细胞？像这样的大载体转化我们一般是离心下来然后全部涂板或者至少要涂一半。
再次提醒：别忘了蓝白斑筛选。

最后问一句楼主用的真的是1300？上面没有启动子你只连一个基因上去怎么做表达啊？担心中。。。

PS:楼上的帖子有个小错误，PUCCRNAi上没有启动子

[ Last edited by lzhwin on 2009-11-30 at 17:23 ]
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18楼2009-11-30 13:03:01
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
1. 确保酶切没有问题，
2. 不行就电转试试
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
19楼2009-11-30 17:37:54
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