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36678293

铜虫 (正式写手)

[交流] 基因克隆到pCAMIBA1300

请教各位:


我的一个基因(1.5kbp)想克隆到pCAMBIA(12kbp,kan)上,但是做了好多次链接,就是连不上去,PCR双酶切链接试过了,基因从T载体上切下在链接也试过了,但是就是不长斑,感受态的效率也没问题,XL-GOLD的,10的8次方的效率应该有;链接酶试过SOLITION 1,和T4, 链接体系10ul和20ul都试过了,载体与片段的比例1:1--1:10都做过了。

可是就不是不知道什么原因,在这里请教大家了。。。。


不懂的不要留言,谢谢!!!

[ Last edited by 36678293 on 2009-11-9 at 19:34 ]
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人

★ ★ ★ ★
36678293(金币+1,VIP+0):谢谢!!! 11-9 21:34
amisking(金币+3,VIP+0): 11-10 08:23
lz很辛苦哈~
帮你顶个帖

偶根据自己和别人的经验,废话几句
12k+1.5k的不算小啊,或许你那些不同的搭配里面有最佳的组合,也许并不是那些未知的原因导致链接失败,有可能是确实本身效率很低~~~
偶的导当年连6k+12k的,连了俩月,最终还是成功了~最终也没发现新的原因~重复而已~~~
废话几句,别介意

ps一句,适当降低kan的浓度,或许会好点

[ Last edited by scelab on 2009-11-9 at 21:31 ]
小木虫之有关部门负责人
3楼2009-11-09 21:27:51
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zjwang

木虫 (正式写手)

遇到类似的问题,关注中
2楼2009-11-09 20:08:45
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changes

木虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+5,VIP+0): 11-10 08:23
Kana平板长斑吗?若是长斑但是验证不是的话,那就是1300载体酶切开。
若是Kana平板不长斑,1300空载体也不长的话,就是培养有问题了。
个人认为还是1300载体双酶切有问题,导致连接不上。
是分步酶切还是同时双酶切?建议单酶切试试。另外挑斑时多挑几个。10个就差不多了。
4楼2009-11-09 22:46:12
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36678293

铜虫 (正式写手)

是,分步酶切
1300空载体的单菌落数量10的4-5次方(质粒1ul,感受他10ul)

链接产物一个班都不长!!!
5楼2009-11-10 00:08:46
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