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夏末～易科

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[交流] 5分钟掌握CCK8实验！从原理到避坑指南，细胞增殖检测一篇就够了

5分钟掌握CCK8实验！从原理到避坑指南，细胞增殖检测一篇就够了
CCK8是什么？
定义：CCK-8（Cell Counting Kit-8）是一种高灵敏度、无放射性的细胞增殖/毒性检测试剂，基于WST-8（水溶性四唑盐）还原反应。
检测原理：活细胞线粒体中的脱氢酶将WST-8还原为橙黄色水溶性甲瓒（formazan），其颜色深度与活细胞数量成正比，450nm波长下检测OD值即可定量细胞活性。

标准实验流程（贴壁细胞为例）
1. 铺板：
96孔板接种细胞（约1,000-10,000个/孔），每孔100μL培养基。
设置：空白组（仅培养基）、对照组（无处理细胞）、实验组（药物处理）。
2. 孵育处理：
37℃培养箱中处理目标时间（如24/48/72h）。
3. 加CCK8试剂：
每孔加入10μL CCK8溶液（避光枪头操作！）。
轻摇混匀，避免产生气泡。
4. 检测读数：
37℃孵育1-4小时（时间需预实验优化）。
酶标仪检测450nm吸光度（参比波长600-650nm）。
7大避坑指南
1. 孔板边缘效应：
→ 边缘孔填充PBS/培养基，减少蒸发误差。
2. 气泡干扰读数：
→ 加样后用移液器轻轻吹打消泡。
3. 时间窗口敏感：
→预实验确认最佳孵育时间（OD值达0.8-1.2最佳）
4. 培养基干扰：
→RPMI-1640需避光（含酚红干扰），建议换无酚红培养基。
5. 避光操作：
→ WST-8见光易降解，全程避光保存试剂及孔板！
6. 细胞密度控制：
→ 增殖实验：细胞不宜过多（防止接触抑制）；
→ 毒性实验：密度适中（过少灵敏度下降）。
常见问题Q&A
Q：CCK8能否用于悬浮细胞？
可以！需离心去除上清，重新悬浮后检测（防止细胞沉淀影响OD值）。
Q：OD值为负值或波动大？
→ 可能原因：
① 细胞死亡过多（药物毒性过强）；
② 空白对照组污染（如残留血清干扰）。
Q：数据重复性差？
→检查：加样均一性、孵育温度稳定性、酶标仪孔间误差。
数据解读公式
细胞活力（%）=[(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)]× 100%
应用示例：药物抑制率 = 100% - 细胞活力%
进阶技巧
动态监测：同一孔板多次读数（每2小时检测一次，观察增殖曲线）。
联用方案：CCK8 + Annexin V/PI验证凋亡，或联合划痕实验分析迁移抑制。
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1楼2025-08-07 16:50:52

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