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夏末～易科新虫 (小有名气)
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慢病毒实验步骤
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慢病毒实验步骤 以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1x106个293T细胞。 1.取1.5ml灭菌EP管，加入1.5ug包装混合质粒和0.5ug表达质粒以及250ul的无血清培养基。轻柔混匀，室温孵育 5min。 2.取1.5ml灭菌EP管，取9ul 脂质体20001溶于250ul无血清培养基中。轻柔混匀室温孵育5min。 3.将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀室温孵育20min 4.用胰酶消化并记数293T细胞。用含血清的培养基重悬细胞。 5.在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物， 6.将1ml重悬的293T细胞(1x106个细胞/ml)加入到平板中。37℃℃CO2孵箱中孵育过夜。 7.移除含有DNA-脂质体复合物的培养基移除，代之以DMEM(含丙酮酸钠和非必须氨基酸) 8.转染后48-72h收获含病毒的上清。3000 rpm 离心20min，去除沉淀， 9.病毒上清-80℃贮存。包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。 注意事项： 1.慢病毒理论上可以包装5~7Kbp的片段，但过大的片段包装会影响病毒的出毒效率，导致获得的病毒度较低，影响病毒感染效果。因此一般建议最好将包装的片段控制在1.5Kbp以内。 2.病毒载体易突变和丢失，克隆过程中可能出现质粒的包装信号突变或大小不等的片段丢失，导致无法成功包装出病毒。因此建议构建好含有目的基因的克隆载体(尤其插入片段大于1.5Kbp)后首先进行测序，以确保关键序列都正确无误。 3.包装细胞多选择为293T或293FT。要求细胞生长旺盛、状态良好，避免过密生长和体外传代次数过多， 4.转染时对质粒纯度要求较高，最好为去掉内毒素的超螺旋质粒，以提高转染效率。多采用磷酸钙转染方法，既节约成本又可获得高的转染效率(一般可达到80%~95%)。 5.无论是三质粒或四质粒慢病毒系统，转染的各质 粒之间的比例非常重要，直接影响出毒效率。不同公司提供的质粒有所差别，因此无法一概而论，需要根据给出的比例进行调整优化。 6.转染前，细胞密度控制在50%~60%为佳。转染前4~8h换液，转染后不换液。转染第2天添加丁酸钠(TPA)可明显提高出毒率，之后8h再换液。每次换液前应将培养基预热至37℃℃，换液时动作轻柔以防细胞漂起 7.一般情况下，转染48h后收获得到的病毒颗粒最多，但也与当时细胞状态、生长速度和培养基pH值有关。收获病毒时培养基应呈红色，若过酸呈现黄色则会降低病毒收获率 8.不同厂家和批次的血清对病毒的产量影响很大需要筛选。 发自小木虫手机客户端 |
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