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津渡津渡的生科

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[交流] 简易版 | 核酸分离与纯化、沉淀与浓缩？（附：避免踩雷的黄金步骤）

核酸提取是分子生物学实验的基础环节，其质量直接影响后续PCR、测序等结果的可靠性。

1. 核酸分离与纯化
-  去蛋白技术：
  - 酚/氯仿抽提：交替使用饱和酚和氯仿（比例1:1），氯仿去除色素和蔗糖，异戊醇减少气泡；
  - 硅胶柱/磁珠法：商用试剂盒首选（如Qiagen、天隆科技），磁珠结合核酸后磁性分离，适合自动化操作。

-  杂质清除：
有机相抽提后，氯仿二次处理去除残留酚，乙醚抽提去除痕量氯仿。

2. 核酸沉淀与浓缩
-  乙醇沉淀法：
  - 加入2.5倍体积预冷无水乙醇 + 0.1倍体积3M醋酸钠（Na⁺中和电荷促进聚合）；
  - 低温离心（4℃，12,000g × 15min），75%乙醇洗涤盐分。

-  干燥溶解：
沉淀室温干燥5min（避免过度干燥），用TE缓冲液或RNase-free水溶解。

3. 避免踩雷的黄金步骤
1. 样本前处理：
- 组织块≤25mg，血液≤200μl，过量降低裂解效率。
2. 裂解充分性：
- 裂解液体积＞样本体积3倍，55℃孵育≥30min（组织需延长）。
3. 抽提技巧：
- 吸取上清时留1mm液层，避免吸入蛋白层。
4. 沉淀优化：
-20℃沉淀过夜提升小片段回收率。
5. 污染应急：
- 若假阳性频发：更换引物、使用核酸清除剂（如诺沃赛德，无腐蚀性）。

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1楼 2025-07-03 17:10:49

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