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二代测序文库筛选步骤
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磁珠进行核酸片段筛选的步骤基于SPRI技术和磁场分离原理，通过磁珠与DNA片段的特异性结合实现目标片段的分离。以下是具体操作流程及关键要点： 一、实验准备 1. 磁珠平衡 将磁珠从冰箱取出，室温平衡至少30分钟，避免低温破坏表面修饰基团。 2. 试剂配制 现用现配80%无水乙醇（体积比8:2）。 根据目标片段大小选择磁珠比例（参考各厂家磁珠分选比例表）。 二、双轮分选法（适用于NGS文库构建） 第一轮：去除大片段（右侧清除） 1. 磁珠与样本混合 按比例（如0.8×）加入磁珠至DNA溶液中，涡旋混匀或移液器吹打10次，室温孵育5分钟。 2. 磁场分离 短暂离心后置于磁力架（如达远辰光磁力架），待溶液澄清（约5分钟），转移上清至新管，残留2μL液体于原管底部，避免吸到磁珠。 第二轮：去除小片段（左侧清除） 1. 加入第二轮磁珠 按比例（如0.2×）加入磁珠至第一轮上清中，重复混匀、孵育步骤。 2. 磁场分离与洗脱 分离后弃上清，用80%乙醇漂洗磁珠2次（每次30秒）。 室温干燥磁珠至刚出现龟裂（约5分钟），避免过度干燥。 加入ddH₂O或TE洗脱DNA，室温孵育5分钟后回收上清。 三、单侧分选法（适用于去除短片段） 1. 调整磁珠比例 根据目标片段长度选择磁珠用量（如去除≥1000bp片段用0.6×，去除≥200bp用2.0×）。 2. 结合与分离 混匀磁珠与样本后孵育5分钟，磁力架分离并弃上清。 乙醇漂洗后洗脱DNA，适用于去除引物二聚体或短片段杂质。 四、关键注意事项 1. 分选精度控制 第一轮弃磁珠，第二轮弃上清，确保目标片段被保留。 使用Qsep、Agilent 2100 Bioanalyzer验证分选后片段分布。 2. 操作误差规避 转移上清时使用200μL+10μL枪头，防止吸到磁珠。 初始体积≥100μL，不足时补超纯水以减少移液误差。 五、应用场景示例 NGS文库构建：通过双轮分选获得300-500bp目标片段。 病原体检测：快速分离特定长度的病毒核酸片段。 |
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