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zhouzhou_3006

木虫 (著名写手)

[交流] 同源重组的几个问题

基因敲除中遇到的问题:
1)转化了PKD46的大肠杆菌,制作感受态细胞,感受态方法:先在30°C,200 rpm培养过夜,以1%的比率接入新的LB培养基中,加入10 mM的L-阿拉伯糖(从生工买的BBI公司的,纯度为98%-101%)培养6 h左右,OD600为大概为0.5-1.0;

2)PCR产物:没有经过胶回收或者乙醇沉淀。因为之前敲过一个基因,当时胶回收后离子强度太大,电转时经常击穿,所以就直接用PCR片段进行电转,已经成功敲除了两个基因;

这次按照以前的方法做了一个月了,总是没有菌长出,要不就染菌,染的菌在显微镜下和大肠杆菌几乎没有区别,可是菌落形态有点像枯草芽孢杆菌一类的,气味比大肠杆菌还要难闻;

不知道是感受态的问题还是PCR产物的问题,问题很多,一一排除需要很多时间和精力,有没有内行的人帮忙分析一下,谢谢!
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9528

至尊木虫 (职业作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-11-1 21:25:

1、你做PKD46的大肠杆菌电转感受态的时候加入适量抗生素,使OD长至0.6.
2、你说的电转后直接击穿是什么意思?PCR产物肯定是要回收的,不然浓度不够大,很难电转入。并且PCR产物回收之前一定要讲解模板,不然会 ...

进来学习
古来圣贤皆寂寞,惟有饮者留其名。
4楼2009-11-01 22:15:40
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1949stone(金币+2,VIP+0):谢谢交流 11-1 21:36
引用回帖:
Originally posted by zhouzhou_3006 at 2009-11-1 19:16:
基因敲除中遇到的问题:
1)转化了PKD46的大肠杆菌,制作感受态细胞,感受态方法:先在30°C,200 rpm培养过夜,以1%的比率接入新的LB培养基中,加入10 mM的L-阿拉伯糖(从生工买的BBI公司的,纯度为98%-101%)培 ...

1、你做PKD46的大肠杆菌电转感受态的时候加入适量抗生素,使OD长至0.6.
2、你说的电转后直接击穿是什么意思?PCR产物肯定是要回收的,不然浓度不够大,很难电转入。并且PCR产物回收之前一定要讲解模板,不然会有较多的假阳性。
3、加大抗性板抗生素的浓度。比大肠的气味还难闻?大肠的气味还是蛮好闻的~
2楼2009-11-01 21:25:31
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