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zhouzhou_3006木虫 (著名写手)
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[交流]
同源重组的几个问题
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基因敲除中遇到的问题： 1）转化了PKD46的大肠杆菌，制作感受态细胞，感受态方法：先在30°C，200 rpm培养过夜，以1%的比率接入新的LB培养基中，加入10 mM的L-阿拉伯糖（从生工买的BBI公司的，纯度为98%-101%）培养6 h左右，OD600为大概为0.5-1.0； 2）PCR产物：没有经过胶回收或者乙醇沉淀。因为之前敲过一个基因，当时胶回收后离子强度太大，电转时经常击穿，所以就直接用PCR片段进行电转，已经成功敲除了两个基因； 这次按照以前的方法做了一个月了，总是没有菌长出，要不就染菌，染的菌在显微镜下和大肠杆菌几乎没有区别，可是菌落形态有点像枯草芽孢杆菌一类的，气味比大肠杆菌还要难闻； 不知道是感受态的问题还是PCR产物的问题，问题很多，一一排除需要很多时间和精力，有没有内行的人帮忙分析一下，谢谢！ |
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