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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 同源重组的几个问题
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zhouzhou_3006

木虫 (著名写手)

[交流] 同源重组的几个问题

基因敲除中遇到的问题：
1）转化了PKD46的大肠杆菌，制作感受态细胞，感受态方法：先在30°C，200 rpm培养过夜，以1%的比率接入新的LB培养基中，加入10 mM的L-阿拉伯糖（从生工买的BBI公司的，纯度为98%-101%）培养6 h左右，OD600为大概为0.5-1.0；

2）PCR产物：没有经过胶回收或者乙醇沉淀。因为之前敲过一个基因，当时胶回收后离子强度太大，电转时经常击穿，所以就直接用PCR片段进行电转，已经成功敲除了两个基因；

这次按照以前的方法做了一个月了，总是没有菌长出，要不就染菌，染的菌在显微镜下和大肠杆菌几乎没有区别，可是菌落形态有点像枯草芽孢杆菌一类的，气味比大肠杆菌还要难闻；

不知道是感受态的问题还是PCR产物的问题，问题很多，一一排除需要很多时间和精力，有没有内行的人帮忙分析一下，谢谢！
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为梦想努力。
1楼 2009-11-01 19:16:54
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★
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1949stone(金币+2,VIP+0):谢谢交流 11-1 21:36
引用回帖:
Originally posted by zhouzhou_3006 at 2009-11-1 19:16:
基因敲除中遇到的问题：
1）转化了PKD46的大肠杆菌，制作感受态细胞，感受态方法：先在30°C，200 rpm培养过夜，以1%的比率接入新的LB培养基中，加入10 mM的L-阿拉伯糖（从生工买的BBI公司的，纯度为98%-101%）培 ...

1、你做PKD46的大肠杆菌电转感受态的时候加入适量抗生素，使OD长至0.6.
2、你说的电转后直接击穿是什么意思？PCR产物肯定是要回收的，不然浓度不够大，很难电转入。并且PCR产物回收之前一定要讲解模板，不然会有较多的假阳性。
3、加大抗性板抗生素的浓度。比大肠的气味还难闻？大肠的气味还是蛮好闻的~
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2楼2009-11-01 21:25:31
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kitty8682

金虫 (正式写手)
学习了
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3楼2009-11-01 21:58:49
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9528

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-11-1 21:25:

1、你做PKD46的大肠杆菌电转感受态的时候加入适量抗生素，使OD长至0.6.
2、你说的电转后直接击穿是什么意思？PCR产物肯定是要回收的，不然浓度不够大，很难电转入。并且PCR产物回收之前一定要讲解模板，不然会 ...

进来学习
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古来圣贤皆寂寞，惟有饮者留其名。
4楼2009-11-01 22:15:40
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