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乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）含量检测试剂盒实验解决方案
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原理 乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。是生物体能源物质代谢过程中产生的一种重要的中间代谢产物。在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶A汇聚成一条共同的代谢通路--三羧酸循环和氧化磷酸化，经过这条通路彻底氧化生成二氧化碳和水，释放能量用于ATP合成。此外，乙酰辅酶A是合成脂肪酸，酮体，胆固醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。CheKine™ 乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）含量检测试剂盒（微量法）提供了一种简单、灵敏、快速的乙酰辅酶A检测方法，适合多种类型的样本，如动/植物组织、细胞等样本。其检测原理是苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和NAD生成草酰乙酸和NADH。柠檬酸合酶可催化乙酰辅酶A和草酰乙酸生成柠檬酸和辅酶A。利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应，乙酰辅酶A含量和NADH的生成速率成正比，NADH在340 nm处有特征吸收峰，通过检测340 nm吸光值的计算既可得到乙酰辅酶A含量。 自备耗材 ·酶标仪或紫外分光光度计（能测340 nm处的吸光度） ·制冰机，低温离心机 ·水浴锅 ·96孔UV板或微量石英比色皿 ·可调节式移液枪及枪头 ·去离子水 ·匀浆器（如果是组织样本） 试剂准备 Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。 注意：Extraction Buffer有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。 Working ReagentⅠ：临用前配制，对于48 T，加入175 μL ReagentⅣ充分溶解备用；对于96 T，加入350 μL ReagentⅣ充分溶解备用，未用完的试剂-20℃避光分装保存2周。 Working ReagentⅡ：临用前配制，对于48 T，加入175 μL ReagentⅣ充分混匀备用；对于96 T，加入350 μL ReagentⅣ充分溶解备用，未用完的试剂4℃避光分装保存2周。 Working ReagentⅢ：临用前配制，对于48 T，加入15.75 mL ReagentⅣ充分溶解备用；对于96 T，加入31.5 mL ReagentⅣ充分溶解备用，未用完的试剂-20℃避光分装保存2周。 工作液：临用前配制，将Working ReagentI、Working ReagentⅡ和Working ReagentⅢ按照1:1:90的比例混合，现用现配。 Standard (NADH)：临用前配制，对于48 T，加入0.5 mL去离子水充分溶解备用；对于96 T，加入1 mL去离子水充分溶解备用，得8,000 nmol/mL标准品，未用完的试剂-20℃避光分装保存2周。 标准曲线设置：按照如下表格，用去离子水将8,000 nmol/mL标准品稀释为3,200、1,600、800、400、200、100、50、0 nmol/mL的标准溶液。 序号 标准液体积 去离子水体积（µL） 浓度（nmol/mL） Std.1 100 µL 8,000 nmol/mL 150 3,200 Std.2 100 µL of Std.1 (3,200 nmol/mL) 100 1,600 Std.3 100 µL of Std.2 (1,600 nmol/mL) 100 800 Std.4 100 µL of Std.3 (800 nmol/mL) 100 400 Std.5 100 µL of Std.4 (400 nmol/mL) 100 200 Std.6 100 µL of Std.5 (200 nmol/mL) 100 100 Std.7 100 µL of Std.6 (100 nmol/mL) 100 50 Std.8 0 200 0 注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在4小时内使用。Std.8即空白孔。 样本制备 注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。 1.细胞样本：收集细胞样本到离心管内，弃上清，按照每500万细胞加入1 mL Extraction Buffer，超声破碎细胞（功率20%，超声3 s，间隔10 s，重复30次），13,000 g，4℃离心10 min，取上清，置冰上待测。 2.组织样本：称取0.1 g组织，加入1 mL Extraction Buffer，进行冰浴匀浆，13,000 g，4℃离心10 min，取上清，置冰上待测。 注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3002的蛋白质定量试剂盒（Bradford法）进行样本蛋白质浓度测定。 实验步骤 1.酶标仪或紫外分光光度计预热30 min以上，调节波长到340 nm，紫外分光光度计用去离子水调零。 2.工作液于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育10 min。 3.操作表：在96孔UV板或微量石英比色皿中，按照下表进行实验 试剂 测定孔（μL） 标准孔（μL） 样本 25 0 不同浓度的Std. 0 25 工作液 230 230 4.混匀，测定孔立即读取340 nm处20秒的吸光值A1和1分20秒时的吸光值A2，计算ΔA测定=A2-A1，标准孔读取340 nm处1分20秒时的吸光值A标准，ΔA标准=A标准-A空白。 注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果吸光度大于1.5，可以减少样本量，如果吸光度太低，可以减少Extraction Buffer体积。 结果计算 注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。 以ΔA标准为x轴，标准品浓度为y轴，制作标准曲线，得到方程，将ΔA测定带入方程，得到y值。 1. 按样本蛋白浓度计算： 乙酰辅酶A含量(nmol/mg prot)=(y×V样)÷(V样×Cpr)=y÷Cpr 2. 按样本鲜重计算： 乙酰辅酶A含量(nmol/g 鲜重)=(y×V样)÷(W×V样÷V提取)=y÷W 3. 按细胞密度计算： 乙酰辅酶A含量(nmol/104 cells)=(y×V样)÷(500×V样÷V提取)=y÷500 V样：加入样本体积，0.025 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；V提取：加入提取液体积，1 mL；500：细胞总数，500万。 结果展示 参考标曲如下： Figure 1. NADH的标准曲线 |
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