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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 枯草芽孢杆菌异源表达胰蛋白酶酶活问题
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【悬赏金币】回答本帖问题，作者秦风拂面将赠送您 20 个金币

秦风拂面

新虫 (初入文坛)

[求助] 枯草芽孢杆菌异源表达胰蛋白酶酶活问题 已有1人参与

大家好，想向大家请教一个问题。

鄙人的问题是这样的：
       我以枯草芽孢杆菌专用的质粒pwb980为载体，构建了用以表达链霉菌胰蛋白酶的重组质粒，并将其转化至枯草芽孢杆菌SCK6中，后续的转化子测序鉴定结果显示我的重组质粒转化成功。紧接着我将该重组菌株扩培发酵产酶并测定酶活，结果显示有酶活。但是我第二次接种相同的甘油管菌株发酵产酶，但是却无酶活。不知道问题出在哪里。

      我细细观察了一下，发酵产酶时的培养液是偏白的，发酵不产酶时的培养液是偏黄绿色的，不知道为什么会有这种差异情况出现，按理说接种的是同一支甘油管菌里的原始菌株，且培养基配方是相同的。

       后续我也使用载体的通用引物进行了PCR鉴定，结果显示我的目的条带存在，质粒也未丢失。同时我也重新进行了质粒的重组转化，测序结果也正确，但是发酵产酶也依旧无酶活。但是我第一次转化时的确显示重组菌株产酶，且具有较高的酶活。

       希望大佬们能指点一下迷津，鄙人感激不尽，金币也奉上。
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1楼 2024-11-04 11:45:42
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ap372767129

铁虫 (正式写手)
那只能再发酵一次看看，枯草发酵温度一般是在25度，需不需要诱导剂。偶尔会出现发酵没有酶活的问题。

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2楼2024-11-18 18:36:24
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wangqi1107

银虫 (小有名气)
现在问解决了吗？是不是表达的酶不在培养基里，在胞内的，可以破碎细胞试试测酶活。我也在准备做枯草，正在找菌株。
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3楼2024-12-05 11:23:33
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

构建的载体检查下有没有发生移码突变，第一次测有酶活，有没有可能测错了？另外就是需要加诱导剂不？保存的甘油菌在哪里放着？应该在-80放的。还有就是表达的酶是分泌到培养液里吗？有时候会出现，你想着是分泌到培养液里，其实没有分泌到培养液里。
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4楼2025-01-04 17:32:05
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