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youngman57

铁虫 (初入文坛)

[交流] 质粒中多余片段的消除 已有4人参与

想问一下各位大佬,怎么将质粒上多余的片段删掉,我用的无缝克隆的方法,但是失败了,我先设计引物pcr,之后连接转化到dh5α中,在培养基中也长出了单菌落,就是使用菌落pcr时p不出来条带,按道理来说应该有条带的,对照我用的质粒可以p出来,三千的条带,删除多余的按道理来说应该有二千的条带,但是就什么条带都没有,不知道怎么回事,望大佬能说一下,我实验室有人也是真么做的就可以。
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傲娇小丫头

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
无缝克隆--同源重组  引物设计是否正确?
引物无误的话,可以挑几个单菌落送测序看看
一万年太久,只争朝夕。。。。。
2楼2024-11-05 09:18:45
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1420488582

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
无缝克隆同源重组方案:
方案设计的扩增引物要带有载体同源臂
线性载体处理背景要处理干净

你这个原因,因该是没有构建成功
江苏赛索飞生物科技有限公司(引物合成,基因合成,一代测序,蛋白,病毒包装)
3楼2024-11-12 11:00:30
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strongFv

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
如果长了单菌落但是P不出来,也可能是扩增的问题,菌模板本身不好P。可以试试用菌P专家这一类专用的酶试试(达领生物的),或者重新设计鉴定引物,缩短扩增长度,也会更好P一点。
4楼2024-12-18 11:32:03
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huanglyxm

至尊木虫 (知名作家)

认真就输了


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
同源臂可以稍微长一点,反正引物低于59个碱基都是五毛钱,20个bp的同源臂总觉得不太够。

发自小木虫手机客户端
时间可以回到起点,却已不再是昨天
5楼2024-12-24 11:36:08
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