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PCR检测技术操作步骤
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简单来说分为以下三个步骤：✦DNA变性，加热使靶DNA序列双链解离成单链DNA。引物与靶DNA退火，适当降低温度，使两个引物分别结合成靶DNA两条的3′末端向5′末端延伸。引物延伸，在DNA聚合酶的催化下，引物沿着靶DNA3′末端向5′末端延伸。新合成的DNA链在变性解离后，又可作为模板与引物杂交，并且在DNA聚合酶的催化下，引导合成新的靶DNA链。如此反复进行以上3个步骤，即可使靶DNA片段指数性扩增。 具体操作步骤如下：✦1.在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。 10×PCR buffer 5 μl dNTP mix （2mM） 4 μl 引物1（10pM） 2 μl 引物2（10pM） 2 μl Taq酶 （2U/μl） 1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl 加ddH2O至 50 μl 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，最后在72℃ 保温7min。 3.结束反应。PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。4.PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。 虽然，PCR技术已经相当成熟，但对于一个传统实验室，不但要满足高科技的实验设备，合理的空间布局等基本条件，一般还具有人员素质专业性高、管理严谨度高、投入成本高、结果责任性高等特点。 |
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