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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » overlap PCR求助
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糖霜果子

新虫 (初入文坛)

[求助] overlap PCR求助

我想把A,B两个基因通过overlap pcr方法连在一起，A引物是F1/R1，B引物是F2/R2，且两片段之间有33 bp的同源臂。AB都扩增出来回收，现在用overlap PCR出现了非特异型扩增，一开始先不加引物，其他正常加，进行18个循环，退火温度55℃，待温度下降，再加上引物进行33个循环。primer用的还是原来的，一个片段的上游引物，一个片段的下游引物，延伸时间增加了一倍，有许多非特异条带，还有比目的条带还要大的，有大佬指点一下嘛，各位有好一点的建议？不胜感激，谢谢。

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1楼 2024-07-29 02:36:24
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tianyu1201

木虫 (著名写手)
如果是构载体，直接用同源重组做不行吗？

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被故事选中，没资格懵懂
2楼2024-08-01 00:41:09
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guoliwang

至尊木虫 (职业作家)
如果实验目的只是获得重组基因，不用管非特异条带。把disired band切下来重组测序就好。只要获得一个正确的重组克隆就是成功。当然改善实验条件和重组测序可以同时进行。overlap后的总长度有多长？一般不需要增加延伸时间。如果要改善特异性，我的第一选择都是提高淬火温度。
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慎思明辨博学笃行
3楼2024-08-01 07:29:04
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1420488582

新虫 (初入文坛)
扩增引物看下是不是有错配，一般如果没有错配，就算出现非特异性条带也不会太多
扩增循环数不要太多，23个循环就够了，正常一轮扩增可以不用回收，直接二轮用A的上游引物和B的下游引物做拼接就行
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江苏赛索飞生物科技有限公司（引物合成，基因合成，一代测序，蛋白，病毒包装）
4楼2024-08-06 17:09:29
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糖霜果子

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 1420488582 at 2024-08-06 17:09:29
扩增引物看下是不是有错配，一般如果没有错配，就算出现非特异性条带也不会太多
扩增循环数不要太多，23个循环就够了，正常一轮扩增可以不用回收，直接二轮用A的上游引物和B的下游引物做拼接就行

好的，我试试先降低循环数

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5楼2024-08-11 01:30:14
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