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糖霜果子

新虫 (初入文坛)

[求助] overlap PCR求助

我想把A,B两个基因通过overlap pcr方法连在一起,A引物是F1/R1,B引物是F2/R2,且两片段之间有33 bp的同源臂。AB都扩增出来回收,现在用overlap PCR出现了非特异型扩增,一开始先不加引物,其他正常加,进行18个循环,退火温度55℃,待温度下降,再加上引物进行33个循环。primer用的还是原来的,一个片段的上游引物,一个片段的下游引物,延伸时间增加了一倍,有许多非特异条带,还有比目的条带还要大的,有大佬指点一下嘛,各位有好一点的建议?不胜感激,谢谢。

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tianyu1201

木虫 (著名写手)

如果是构载体,直接用同源重组做不行吗?

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被故事选中,没资格懵懂
2楼2024-08-01 00:41:09
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guoliwang

至尊木虫 (职业作家)

如果实验目的只是获得重组基因,不用管非特异条带。把disired band切下来重组测序就好。只要获得一个正确的重组克隆就是成功。当然改善实验条件和重组测序可以同时进行。overlap后的总长度有多长?一般不需要增加延伸时间。如果要改善特异性,我的第一选择都是提高淬火温度。
慎思明辨博学笃行
3楼2024-08-01 07:29:04
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1420488582

新虫 (初入文坛)

扩增引物看下是不是有错配,一般如果没有错配,就算出现非特异性条带也不会太多
扩增循环数不要太多,23个循环就够了,正常一轮扩增可以不用回收,直接二轮用A的上游引物和B的下游引物做拼接就行
江苏赛索飞生物科技有限公司(引物合成,基因合成,一代测序,蛋白,病毒包装)
4楼2024-08-06 17:09:29
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糖霜果子

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 1420488582 at 2024-08-06 17:09:29
扩增引物看下是不是有错配,一般如果没有错配,就算出现非特异性条带也不会太多
扩增循环数不要太多,23个循环就够了,正常一轮扩增可以不用回收,直接二轮用A的上游引物和B的下游引物做拼接就行

好的,我试试先降低循环数

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5楼2024-08-11 01:30:14
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