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一种人工复合丝素蛋白支架有效促进糖尿病伤口愈合 已有1人参与
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【摘要】 慢性糖尿病伤口仍然是全球公认的临床挑战，高浓度活性氧 （ROS） 诱导的伤口微环境紊乱是其主要成因。伤口微环境中的血管生成障碍和炎症最终会阻碍正常的愈合过程。因此，靶向巨噬细胞和血管内皮细胞功能障碍是一种很有前途的治疗策略。胡志成团队制造了由柚皮苷/羧甲基壳聚糖/透明质酸钠/丝素蛋白（NG/CMCS/HA/SF） 组成的人工复合支架，以促进伤口愈合。NG/CMCS/HA/SF支架在体外和体内实验中都表现出良好的抗炎、抗氧化和促血管生成性能，有效促进糖尿病伤口愈合。观察到的积极治疗效果表明，复合支架在临床伤口愈合应用中具有巨大的潜力。 NG/CMCS/HA/SF复合支架通过冷冻干燥完成。为了进行比较，CMCS、NG/CMCS 和 CMCS/HA/SF 支架均使用同种标准化方法制备。 【研究内容】 图1A 显示了四个不同 CMCS 支架的 SEM 图像，它们都表现出多孔结构。图1B和C分别显示了所制备的CMCS和基于CMCS的支架的吸水率和水蒸汽透过率，所有支架都表现出高吸水率，其中CMCS/HA/SF支架的吸水率最高。图1D和E显示了PBS和PBS溶菌酶溶液中CMCS和基于CMCS的支架的降解曲线。结果表明，所有四种变体CMCS支架在PBS和PBS溶菌酶环境中都是可降解的，降解时间线延长至21天，突出了它们在生物医学应用中的潜在适用性，特别是在伤口愈合方面。图1F显示了NG/CMCS和NG/CMCS/HA/SF复合支架的NG的体外释放曲线。结果表明，与NG/CMCS支架相比，NG从这两个支架的释放持续长达120h，NG/CMCS/HA/SF支架始终表现出更高的NG释放速率。图1G显示了不同的支架中的细胞活力，NG/CMCS/HA/SF支架中的细胞活力最高。图1H显示了不同浓度的NG对细胞的细胞毒性，图1G和H表明NG是无毒的，甚至随着浓度的增加而促进其生长，验证了其在伤口修复中的潜在适用性。SEM图像（图1I）显示NHDF细胞更有效地粘附在CMCS/HA/SF和NG/CMCS/HA/SF支架上，显示出正常的细胞形态。 图2 A展示了ROS诱导环境中HUVEC的细胞活力，连续培养3天后，氧化应激损伤显著抑制了HUVECs的活力。然而，NG/CMCS和NG/CMCS/HA/SF支架都能够在一定程度上提高HUVEC的活力，且NG/CMCS/HA/SF支架更有效。如图2B所示，与细胞活力实验一致，制备的NG/CMCS/HA/SF支架在上调这些血管生成相关基因的表达方面表现出更明显的作用，这些细胞因子的表达增强可能有助于促进伤口愈合。图2C展示了NG/CMCS和NG/CMCS/HA/SF支架均有效缓解了HUVECs线粒体膜电位（φM）的降低，其中NG/CMCS/HA/SF支架表现出优异的效果。图2D和E表明，ROS微环境损害了HUVEC的管形成和迁移能力。然而，NG/CMCS或NG/CMCS/HA/SF支架的引入显著增强了血管生成。NG/CMCS/HA/SF组的迁移率较高，促进HUVEC管形成更有效。此外，NG/CMCS组部分恢复了迁移能力和管形成能力，突出了这些支架在氧化应激下支持内皮细胞功能的有效性。 图3A和B表明ROS微环境导致抗炎细胞因子的显着下调和促炎细胞因子的上调。然而，NG/CMCS或NG/CMCS/HA/SF支架的存在可以增强M2表型相关基因（CD206、IL10和ARG-1）的表达，并显著下调促炎基因（IL1β、CD80和INOS）的表达。从图3C和D可以看出，M1表型两极化；而CD206阳性细胞的比例保持不变。此外，NG/CMCS和NG/CMCS/HA/SF支架在ROS微环境下促进THP-1细胞（PMA处理）的M2表型作用，同时抵消诱导的M1分化。ELISA分析显示，在用NG/CMCS或NG/CMCS/HA/SF支架处理的THP-1细胞中，促炎细胞因子（TNF-α、IL1β和IL6）显著减少，抗炎细胞因子（TGF-β、bFGF和IL10）显著增加（图3E和F）。 图4B显示了接受各种治疗的伤口的代表性图像，使用Image-J软件定量分析伤口闭合速率（图4C）。在观察期间，与其他组相比，CMCS/HA/SF/NG支架的处理效率更高。NG/CMCS组的治疗效果与CMCS/HA/SF组相当。用NG/CMCS/HA/SF支架治疗的伤口在第15天几乎完全愈合，优于CMCS、NG/CMCS和CMCS/HA/SF支架观察到的愈合进展。这些结果表明，与其他制备的支架相比，NG/CMCS/HA/SF支架促进了更快的伤口愈合过程。为了评估ROS微环境中工程支架的抗氧化能力，在第5天使用DCFH-DA荧光探针量化了用各种支架治疗的伤口中的ROS水平（图4D）。流式细胞术结果显示，与CMCS组相比，其他三组的ROS水平降低。由于NG的抗氧化特性，NG/CMCS组和NG/CMCS/HA/SF组均有效降低了ROS水平，其中NG/CMCS/HA/SF组表现出更明显的效果。 与其他组相比，NG/CMCS/HA/SF支架组从早期阶段开始表现出增强的胶原沉积，其特征是皮肤组织中的胶原纤维更致密、更厚、排列更整齐，如图5A和C所示。图5B和D在用各种支架治疗20天后，伤口部位的表皮层厚度显着变化。NG/CMCS/HA/SF支架组表皮层厚度明显改善。这些发现表明，NG/CMCS/HA/SF支架不仅促进了高质量的胶原沉积，还促进了表皮层的形成，从而加速了糖尿病伤口的愈合过程。 结果显示，NG/CMCS/HA/SF支架组内新生血管形成明显增强，在第10天达到峰值，随后明显下降（图6C）。同时，其他组中新血管的形成也随着时间的推移而减少。到第15天，除CMCS组外，所有组的新生血管形成程度相似。一般来说，有效的伤口再生涉及减少对营养和氧气的需求，从而导致血管形成减少和这些血管在愈合过程中的消退。这些结果表明，NG/CMCS/HA/SF支架具有优异的促血管形成能力。 图7A和B显示第5天CMCS组中INOS（M1巨噬细胞标志物）的明显表达，与几乎不存在CD206阳性M2巨噬细胞形成鲜明对比。相比之下，其他三组，特别是NG/CMCS/HA/SF组，在同一时间点表现出INOS阳性细胞的显着减少和CD206阳性细胞的显着增加。IHC和qRT-PCR分析进一步证实了NG/CMCS/HA/SF支架在抑制炎性细胞因子表达方面的实质性影响。如图7C所示，与CMCS组相比，NG/CMCS/HA/SF组IL1β、IL6和TNF-α的表达水平显著下调。与NG/CMCS和CMCS/HA/SF，组相比，该组对这些细胞因子的抑制也表现出更好的效果。表明NG/CMCS与HA/SF联合的协同作用显着增强了治疗效果，特别是在调节巨噬细胞极化和减少伤口愈合过程中的炎症方面。 【结论】 胡志成团队设计了一种专为伤口愈合而设计的复合支架。这种支架不仅具有伤口敷料的物理特性，而且能主动调节伤口的微环境。一系列实验表明，NG/CMCS/HA/SF支架可有效缓解ROS诱导的血管内皮细胞和巨噬细胞功能障碍。它促进细胞增殖和血管生成，同时促进巨噬细胞极化，形成组织再生的M2表型并减少炎症。通过这些机制，NG/CMCS/HA/SF支架可以管理ROS微环境，从而促进全层糖尿病伤口的愈合。因此，制备的支架成为加速伤口愈合的有前途的工具，在广泛的生物医学领域显示出巨大的应用潜力。 【通讯作者简介】 胡志成，中山大学第一附属医院烧伤伤口修复科，主任医师。一直从事烧伤、整形、创面修复外科医疗、教学和科研工作。擅长大面积严重烧伤救治，对特殊原因烧伤如电击伤、化学烧伤、放射性损伤以及烧伤复合伤如热压伤、爆震伤等有较丰富的救治经验。运用“创面床准备”理论，应用封闭式负压吸引、自体细胞移植、皮片移植和皮瓣移植等综合方法治疗各种难愈性创面有较丰富的经验，如外伤性溃疡、糖尿病性溃疡、血管性溃疡、压力性溃疡、肿瘤性溃疡等。对于增生性瘢痕、挛缩性瘢痕、瘢痕疙瘩、各类体表肿物、血管瘤、黑色素瘤、先天性巨大黑痣、皮肤癌的整形修复手术以及常见美容手术，对于皮肤软组织撕脱伤、感染、坏死性筋膜炎、各类创伤缺损有独到之处。近年来，积极开展精准医学与康复医学治疗，如3D打印技术，参编烧伤康复、创面康复等专著。 【文章信息】 Hao Yang, Hailin Xu, Dongming Lv, Shuting Li, Yanchao Rong, Zhiyong Wang, Peng Wang, Xiaoling Cao, Xiaohui Li, Zhongye Xu, Bing Tang, Jiayuan Zhu, Zhicheng Hu,The naringin/carboxymethyl chitosan/sodium hyaluronate/silk fibroin scaffold facilitates the healing of diabetic wounds by restoring the ROS-related dysfunction of vascularization and macrophage polarization,International Journal of Biological Macromolecules,Volume 260, Part 1,2024,129348,SSN 0141-8130. 原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.129348 |
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