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seabluebaby

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[交流] RNA病毒反向遗传学研究进展

近年来，在分子病毒学研究领域兴起一门新型技术，即在RT-PCR和体外转录RNA技术基础上建立起来的全长感染性cDNA克隆技术，也叫反向遗传操作技术(reverse genetics manipulation )，又名“病毒拯救(rescue of virus)”，它解决了对病毒基因组RNA难以操作这一难题。从cDNA克隆拯救出负链RNA全病毒是90年代分子病毒学研究领域最振奋人心的突破之一，它开启了人们对病毒基因组进行人工操作以及详细了解病毒基因及其产物功能的大门。该技术发展迅速，倍受国内外研究者关注。
与经典的从表型改变到进行基因特征研究的思路相反，反向遗传操作技术是指通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，将病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在DNA分子水平上对其进行体外人工操作，由病毒基因组cDNA和各种辅助蛋白来组装新的RNA病毒的一项技术。由于最终“拯救”出的RNA病毒来源于cDNA克隆，因此，可通过中间过程中人为加入的DNA环节，在DNA水平上对RNA病毒基因组进行各种体外人工操作，如进行基因突变、基因敲除（缺失）、基因插入、基因置换和基因互补（即构建嵌合病毒）等改造，以此来研究RNA病毒的基因复制和表达调控机理、RNA编辑和自发重组与诱导重组、病毒与宿主间的相互作用关系（如插入报告基因来研究病毒在宿主细胞间的传递机制）、抗病毒策略、基因治疗研究以及构建新型病毒载体表达外源基因和进行疫苗的研制等。
1976年Goff S. P等首先报道成功拯救出SV40 DNA病毒突变株，虽然拯救出的不是RNA病毒，但这是最早的有关病毒拯救的报道。1978年，Taniguchi T 等报道从全长cDNA克隆拯救出在细菌中有感染性的Qβ噬菌体。接着，基因组长约150kb的单纯疱疹病毒和长约190kb的痘苗病毒的重组病毒的成功拯救及有关研究是病毒学研究的领域重大突破。为在早期反向遗传操作体系的建立奠定了基础。

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1楼 2005-12-30 13:44:15

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seabluebaby

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负链RNA病毒复制的大致过程是：首先病毒通过其表面糖蛋白与宿主细胞的特异性受体结合，接着病毒囊膜与细胞浆膜（即通过不依赖于PH途径）或有酸性环境的核内体膜（PH依赖途径）融合后释放病毒核糖核蛋白复合体（RNP）至细胞浆，在转录过程中每一mRNA得以合成，而通过复制产生全长反义基因组RNA，使其作为病毒基因组RNA的模板。很多负链RNA病毒在感染细胞的胞浆中复制，而一些正粘病毒和布尼亚病毒在细胞核中复制。新合成的RNP复合体与病毒结构蛋白在细胞浆膜或高尔基体膜组装，然后释放新合成的子代病毒。
在动物正链RNA病毒的研究上，1996年，Meyers G等[129]构建了猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）基因组全长cDNA克隆，将cDNA克隆体外转录后获得的RNA转染猪肾细胞后最终产生了有感染性的CSFV，虽然拯救出的带有遗传标记的CSFV比野生型生长能力上差一些，但仍具有感染性。这是较早的有关CSFV拯救的报道。此外，有报道首先建立表达T7 RNA 聚合酶的猪肾细胞系SK6，然后将CSFV基因组cDNA克隆线性化后转染该细胞系，结果成功拯救出与野生型CSFV生物学特性一样的病毒，且病毒的效价比用体外制备转录本的方法高200倍，如对cDNA克隆不进行线性化直接用环型重组体进行转染，则拯救出的病毒效价高20倍[130]。此外，在CSFV疫苗株C株的反向遗传研究上已有很多报道，其中在对标记疫苗、病毒复制、毒力和宿主特异性等方面都有相关报道。

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2楼2005-12-30 13:46:33

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