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科研顾问_Gu新虫 (小有名气)
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干货分享 | 电泳验证，RNA品质一目了然——拒绝空谈，用事实说话！
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前言：最近中科院遗传所许同学有个疑问：他提出来的RNA仪器数据很好，就是荧光定量做不出来，是什么原因呢？ 数据是真漂亮 我建议他跑电泳后再聊，下面是对应的电泳图： 完全降解！这样的RNA质量能做出来荧光定量才怪呢 所以：不跑电泳就谈RNA质量好坏的，都是耍流氓！因为仪器NarnoDorp2000不能区分DNA和RNA，完全降解的RNA也能读出高纯的OD比值和高浓度数据，所以仪器数据在RNA电泳图合格的前提下才有参考意义！ 下面只从RNA电泳图，谈谈如何判断RNA的质量： 总RNA的提取方法主要分两种： Trizol沉淀法和RNA吸附柱法。 一、Trizol沉淀法的判断标准：28:18s比例至少为1.5:1 用异丙醇沉淀，或者乙醇沉淀方法提取的RNA，因为5s小片段也可以一起沉淀，所以，一般会见到明显的5s条带，用这种方法提取见到5s条带，是正常的，不提示降解。 这个图片来源于农科院作物所杨老师，Marker左边是invitrogen的Trizol; marker右边是我们的RNAzol。都是上样3uL，由于RNA浓度过高(~5000ng/UL)，电泳条带都快分不开了。 二、RNA吸附柱法的判断标准有两个： 第一个标准：28s:18s=2:1 这个标准的意思是28s、18s是否清晰，条带宽度28s是18s的2倍，尤其是亮度，28S比18s越亮越好。因为降解，总是从大片段开始降解，从28s降解到18s，最后降解到5s。这样降解过程中，28s减少，18s增多，28s：18s比例就会下降。如果最容易降解的28s都没有降解，那么，就推理出：mRNA是完好的了。 第二个标准：5s带不出现 总RNA=mRNA+tRNA+rRNA，即：总RNA就是指mRNA、tRNA、rRNA的总和。这个概念是在还没有发现microRNA的时候的产生的，却被各大RNA提取试剂盒生产公司所默认，一直延续至今。也就是说在市场上你看到的“总RNA提取试剂盒”，只对mRNA、tRNA、rRNA负责，提出来的是这三种RNA的混合物，重点是对mRNA负责。所以各位可以去各大公司的网站，看一看总RNA提取试剂盒案例所配的RNA电泳图，只有代表“总RNA”的2条带——28s和18s；代表microRNA的5s带，要不没有，要不很弱。这就是目前各个公司总RNA提取试剂盒中“总RNA”的概念。 下面这张图片就是一个不同降解情况的典型例子(RNA吸附柱法)。 泳道2是完全正常的RNA——大家可以看到28s:18s比例大约是2:1，5s位置也基本见不到带。这就说明完全正常，无降解。 泳道3,4是完全降解了——28s，18s已经基本降解光了。两条带都看不见了。最后降解成的小片段正好和5s大小一致，所以在5s位置看到了大量的一条浓浓的降解小片段。 泳道1,5,6,7,8,9 部分降解了——28s是RNA大片段，更容易降解，所以28s首先降解，表现为28s条带变淡，18s条带明显变粗，造成28s：18s的比例竟然小于1了。然后在不该看到条带或者应该是很弱的5s位置，出现了较明显的5s大小的降解带。 |
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