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科研战神来了新虫 (小有名气)
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活细胞共染线粒体、溶酶体，这些细节决定成像质量
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线粒体与溶酶体活细胞共染色，是细胞成像、细胞器互作研究的基础常用实验。这套方案操作简单、重复性好，无复杂操作门槛，新手可直接上手实操，适配常规贴壁细胞激光共聚焦成像。一、实验染料选型本次选用两种低背景、高特异性活细胞染料，双通道信号无串扰，成像区分度优异：✅ 线粒体染料：PK Mito Deep Red，638nm激发，标记稳定、背景极低✅ 溶酶体染料：LysoBrite Red，561nm激发，靶向性强、特异性高二、核心实验参数PK Mito Deep Red母液浓度：250μMPK Mito Deep Red工作浓度：100nM标准孵育染色时长：10min三、详细实操步骤1. 前期准备37℃水浴预热无菌PBS缓冲液与细胞完全培养基，备好无菌EP管、移液枪头等耗材，全程保证无菌操作环境，避免污染细胞。2. 配制双染料工作液（现配现用）取1.5mL无菌EP管，加入1mL预热完全培养基，依次加入0.4μL PK Mito Deep Red母液、0.1μL LysoBrite Red母液，轻柔吹打混匀，室温避光暂存备用。3. 细胞样本清洗吸除细胞原有培养基，沿孔壁缓慢加入预热PBS轻柔润洗，彻底吸弃废液，重复清洗2次，去除残留代谢物与旧培养基，降低染色背景。4. 避光孵育染色向细胞样本中加入1mL配制好的染料工作液，平稳放入37℃、5%CO₂恒温培养箱，避光孵育10min，严格把控孵育时长。5. 后置清洗换液孵育结束后吸除染料工作液，用预热PBS清洗细胞2次，洗净游离未结合染料。最后加入新鲜无菌完全培养基，维持细胞活性。6. 上机成像样本制备完成后即刻上机，分别开启561nm、638nm通道拍摄，观察两种细胞器的形态、分布及共定位情况。 四、实操注意事项1. 染料工作液必须现配现用，放置过久会出现染料聚集、活性失效的情况。2. 染色、孵育全程避光，防止荧光染料淬灭，导致信号偏弱。3. 所有试剂提前预热，避免低温刺激细胞，造成细胞状态异常、细胞器形态改变。4. 清洗、加液动作轻柔，沿孔壁操作，防止细胞脱落破损。5. 严格遵从既定染料浓度与孵育时长，规避非特异性染色、背景偏高问题。6. 成像流程快速完成，缩短细胞离体培养时间，保障活体成像效果。  |
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