| 查看: 851 | 回复: 0 | |||
科研顾问_Gu新虫 (小有名气)
|
[交流]
干货分享 | 电泳验证,RNA品质一目了然——拒绝空谈,用事实说话!
|
|
前言:最近中科院遗传所许同学有个疑问:他提出来的RNA仪器数据很好,就是荧光定量做不出来,是什么原因呢? 数据是真漂亮 我建议他跑电泳后再聊,下面是对应的电泳图: 完全降解!这样的RNA质量能做出来荧光定量才怪呢 所以:不跑电泳就谈RNA质量好坏的,都是耍流氓!因为仪器NarnoDorp2000不能区分DNA和RNA,完全降解的RNA也能读出高纯的OD比值和高浓度数据,所以仪器数据在RNA电泳图合格的前提下才有参考意义! 下面只从RNA电泳图,谈谈如何判断RNA的质量: 总RNA的提取方法主要分两种: Trizol沉淀法和RNA吸附柱法。 一、Trizol沉淀法的判断标准:28:18s比例至少为1.5:1 用异丙醇沉淀,或者乙醇沉淀方法提取的RNA,因为5s小片段也可以一起沉淀,所以,一般会见到明显的5s条带,用这种方法提取见到5s条带,是正常的,不提示降解。 这个图片来源于农科院作物所杨老师,Marker左边是invitrogen的Trizol; marker右边是我们的RNAzol。都是上样3uL,由于RNA浓度过高(~5000ng/UL),电泳条带都快分不开了。 二、RNA吸附柱法的判断标准有两个: 第一个标准:28s:18s=2:1 这个标准的意思是28s、18s是否清晰,条带宽度28s是18s的2倍,尤其是亮度,28S比18s越亮越好。因为降解,总是从大片段开始降解,从28s降解到18s,最后降解到5s。这样降解过程中,28s减少,18s增多,28s:18s比例就会下降。如果最容易降解的28s都没有降解,那么,就推理出:mRNA是完好的了。 第二个标准:5s带不出现 总RNA=mRNA+tRNA+rRNA,即:总RNA就是指mRNA、tRNA、rRNA的总和。这个概念是在还没有发现microRNA的时候的产生的,却被各大RNA提取试剂盒生产公司所默认,一直延续至今。也就是说在市场上你看到的“总RNA提取试剂盒”,只对mRNA、tRNA、rRNA负责,提出来的是这三种RNA的混合物,重点是对mRNA负责。所以各位可以去各大公司的网站,看一看总RNA提取试剂盒案例所配的RNA电泳图,只有代表“总RNA”的2条带——28s和18s;代表microRNA的5s带,要不没有,要不很弱。这就是目前各个公司总RNA提取试剂盒中“总RNA”的概念。 下面这张图片就是一个不同降解情况的典型例子(RNA吸附柱法)。 泳道2是完全正常的RNA——大家可以看到28s:18s比例大约是2:1,5s位置也基本见不到带。这就说明完全正常,无降解。 泳道3,4是完全降解了——28s,18s已经基本降解光了。两条带都看不见了。最后降解成的小片段正好和5s大小一致,所以在5s位置看到了大量的一条浓浓的降解小片段。 泳道1,5,6,7,8,9 部分降解了——28s是RNA大片段,更容易降解,所以28s首先降解,表现为28s条带变淡,18s条带明显变粗,造成28s:18s的比例竟然小于1了。然后在不该看到条带或者应该是很弱的5s位置,出现了较明显的5s大小的降解带。 |
» 猜你喜欢
344临床求调剂
已经有0人回复
请问哪位有Nature Electronics期刊的权限,想要下载几篇论文
已经有0人回复
消化系统论文润色/翻译怎么收费?
已经有192人回复
寻找钙钛矿合成方向科研人员、专家或研究生合作
已经有0人回复
求2020年以来放射医学技术视频、习题等备考资料(专业代码:206)
已经有0人回复
有对数字微流控技术感兴趣的吗?欢迎交流
已经有26人回复
生物医学工程270求调剂,已有一篇二区一作
已经有16人回复
1051求调剂,已过六级,英语一60,有科研经历,有意向可电话或邮箱联系
已经有0人回复
大修返回已经8周,发金币祈求个顺利
已经有31人回复
有做有机合成的朋友没
已经有41人回复














回复此楼