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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » pcr鉴定阳性菌落的问题
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)

[交流] pcr鉴定阳性菌落的问题

最近构建重组质粒用pcr进行鉴定，
发现有的样品能够p出大小相符的条带，只是没有阳性对照亮，而以水为阴性对照的样品没有p出条带。
请问有经验的虫友们，这种情况下假阳性的概率是不是很大呢？

[ Last edited by 350784478 on 2009-10-22 at 15:48 ]
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1楼 2009-10-22 14:55:38
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konggy

银虫 (正式写手)
★
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我做的这样的基本都是假阳性
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2楼2009-10-22 15:26:54
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微笑漩涡

新虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
呵呵，不好说，我每次挑20个菌做colony PCR，基本上都能扩增出来，然后再提取质粒酶切，全是阳性的。
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3楼2009-10-22 16:18:20
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yzhang1986

铁杆木虫 (文坛精英)

优秀版主
我没经验
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4楼2009-10-22 18:28:10
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jjlbest

木虫 (著名写手)
★
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菌落PCR只是初步的鉴定，是不是假阳性要酶切鉴定了以后才知道。我的经验来说假阳性挺少的。
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5楼2009-10-22 18:32:25
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zhouzhou_3006

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0): 10-22 18:58
我上次的菌落PCR也P出了条带，但是浓度很低，阳性对照的条带很量，两者大小一致，但亮度差别太大，于是就重做了一次，后来就只有阳性对照能P出来了，所以就认为是假阳性了。lZ的情况只是没有阳性对照亮，所以还是有希望的，再P一次，如果还能P出来，继续做测序或酶切鉴定，不就知道了吗
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为梦想努力。
6楼2009-10-22 18:34:17
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by wordsworth3180 at 2009-10-22 14:55:
最近构建重组质粒用pcr进行鉴定，
发现有的样品能够p出大小相符的条带，只是没有阳性对照亮，而以水为阴性对照的样品没有p出条带。
请问有经验的虫友们，这种情况下假阳性的概率是不是很大呢？

[ Last edit ...

直接用重组质粒进行PCR的话一般是会很亮的，你可以酶切验证一下，那样得到的结果比较可信。
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7楼2009-10-22 22:15:19
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)
谢谢大家的经验
主要是酶切的话切下来的小片断只有100bp，一直都不成功，所以也看不出来。
已经p了几次了，条带都稳定存在
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8楼2009-10-22 22:35:16
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dandan20088810

金虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
菌斑PCR的假阳性是很常见的，因为在我们平时做转化时，把链接产物和感受态细胞混在一起，最后涂平板，在平板上会有好多没有转进去的连接产物，挑取菌斑时会将这些一起挑取，所以也会出现不太亮的目的条带，另外你的目的条带只有100bp这也增加了假阳性的几率。最好用质粒PCR ，或者将转化长出的菌斑，在抗性板划几次，有助于消除假阳性。
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9楼2009-10-23 15:09:30
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